用于從微藻生物質提取可溶性蛋白的方法技術

本發明專利技術涉及一種用于從小球藻屬微藻生物質制備分離蛋白的方法，其特征在于它包括以下步驟：供給一種由發酵產生的微藻生物質；任選地，洗滌該生物質，以便消除可溶性間質化合物，在50℃和150℃之間，優選在100℃和150℃之間的溫度下將該生物質熱透化，持續時間在10秒和5分鐘之間，優選持續時間在10秒和1分鐘之間；將以此方式透化的生物質借助選自下組的固液分離技術進行消除，該組由以下各項組成：正向過濾或切向過濾、絮凝和離心，更確切地，多級離心，以獲得一種可溶性部分；任選地，將由此獲得的可溶性部分通過微孔過濾進行回收和澄清，以便從中除去殘余不溶性元素；在具有小于5kDa，優選在1kDa和5kDa之間的截止閾值的膜上對該可溶性部分進行超濾，以產生一種可溶性分離蛋白；然后將所述分離蛋白蒸發、巴氏滅菌并霧化。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】本專利技術涉及一種用于從微藻生物質提取可溶性蛋白的方法。本專利技術還涉及以此方式獲得的微藻分離蛋白。
技術介紹
所屬領域技術人員熟知，小球藻是一種潛在的食物來源，因為它們富含蛋白質和其他必需營養素。它們被描述為包含45％的蛋白質、20％的脂肪、20％的碳水化合物、5％的纖維素和10％的礦物質和維生素。鑒于其豐度和氨基酸譜，微藻蛋白因此被認為是大豆蛋白或豌豆蛋白的替代性食物來源。蛋白部分也可以被開發為化妝品行業、或甚至醫藥行業中的功能劑。然而，由于在所述部分中存在不希望的化合物(例如葉綠素)而導致包含它們的食物組合物的顏色、味道和結構方面發生不希望的變化，所以在微藻蛋白的食品應用方面的發展尚不顯著。為了增加其在食品應用中的潛力，并且也為了增加其商業價值，因此必須在不影響它們的分子結構的前提下從微藻中提取這些蛋白。“軟”提取技術將因此需要分離具有高溶解度和良好技術和功能特性的蛋白質，但是微藻細胞壁的剛性，尤其綠色微藻的剛性，根本上與這一點矛盾，這是因為它破壞了細胞內蛋白質的提取和完整性。因此，與其相反，常規地“硬”的物理或化學條件被用來破壞微藻細胞壁。因此，許多研究提出了堿溶類型、通過有機溶劑型或高壓勻漿類型提取的技術。然而，在這些技術選擇中，蛋白質的變性未認為是麻煩的，這是因為大多數的這些方法開發，是出于分析的目的，或意在提供用于酶消化的底物，從而產生水解蛋白。然而，保存細胞組分完整性的有效崩解方法具有不僅最大化產率，而且最大化提取的產物的質量的責任。換言之，用于優化崩解壁的方法必須例如避免：-目標產物的化學污染，-使用過高的破裂能；后者可能導致感興趣的細胞內分子的不可逆變性或降解。此外，對于大規模生產而言，對于選擇的方法，重要的是可轉換值這一規模。最后，這一細胞崩解步驟的引入必須是容易的，并且必須對隨后的方法/處理步驟不具有負面影響。所有這些限制影響崩解方法的效率并且由于同樣原因影響其能量消耗。這就是為什么珠磨機技術是優選的，因為它被認為對于按其天然形式釋放細胞內蛋白質是有效的。在珠磨機中，將細胞與小球形顆粒一起以懸浮液狀態攪動。細胞的破碎是由珠間剪切力、碾磨以及與珠的碰撞引起的。例如，專利US5330913中給出了一種適合的珠磨機的描述。這些珠使細胞破裂以從中釋放細胞內容物。然后以“水包油”乳液形式獲得粒徑小于起源細胞的懸浮液。通常霧化此乳液并且消除水，然而留下包含由細胞碎片、間質可溶性化合物和油組成的異質混合物的干燥粉末。在使用這些細胞崩解技術時難以解決的是單獨地分離細胞內內容物(以便排除膜碎片、糖、纖維和脂肪)，并且尤其是保存蛋白負載的質量。在四爿藻屬的微藻的情況下，安雅施文茨法伊爾(AnjaSchwenzfeier)等人(生物資源技術(BioresourceTechnology)，2011，102，9121-9127)提出了保證分離蛋白質的溶解度和氨基酸譜質量的方法，其中污染物(例如染色物質)被除去，該方法包括以下步驟：-用珠磨機進行細胞崩解，-將磨碎的微藻懸浮液離心，-上清液的透析，-穿過離子交換樹脂，-洗脫物的透析，-脫色，然后-洗滌和再懸浮。然而，這種實驗室方法(用于處理24g的生物質)不能放大到工業規模，其中而將珠磨機方法用于回收完整生物質。已經提出了替代解決方案，完全地改變了用于釋放微藻細胞內容物的技術，例如脈沖場電處理。這是因為生物細胞暴露于高強度脈沖電場會改變細胞膜的結構。外源場引起細胞膜的充電。在充足的跨膜電壓(0.5V-1V)下，磷脂的分子排列改變，這導致細胞膜失去其屏障作用，使得它可滲透。取決于使用的條件，這一細胞膜透化會是可逆的或不可逆的。然而，為了有效提取細胞內化合物，本領域普通技術人員建議造成細胞膜的不可逆的透化，由此導致其崩解。然后，細胞膜的這一破裂促進釋放細胞內容物的釋放，并且在使用補充性溶劑提取技術的情況下，也促進溶劑滲透進入細胞。盡管是有前景的，但是不幸地，這一技術并不能外推至工業規模以處理在1m3至200m3的反應器中產生的生物質。其結果是，對于提供用于弱化微藻細胞壁的技術仍存在未滿足的需求，該技術能夠釋放細胞內內容物，而不崩解細胞或削弱其組分的質量。本申請人公司已經發現，這種需要可以通過將用于微藻細胞的熱透化的方法與離心和膜分離(微孔過濾，超濾)的步驟加以組合得到滿足。因此，本申請人公司反對一個技術偏見，該技術偏見認為，用于細胞破碎的熱方法，就像由機械崩解引起的剪切力，是用于降解或變性源自微藻的產物的替代的技術(里奇蒙(Richmond)，1986，微藻大量培養手冊(HandbookofMicroalgalMassCulture)，CRC出版有限公司(CRCPress,Inc)-莫利納格里馬(MolinaGrima)等人，2003，微藻生物質和代謝物的回收：方法選項和經濟學(Recoveryofmicroalgalbiomassandmetabolites:processoptionsandeconomics)，生物技術進步(Biotechnol.Adv.)20:491-515)。此外，一旦釋放自細胞內區室，可以容易地通過離心和膜分離進行分子的回收，只要由本申請人公司開發的熱處理并不導致細胞壁的崩解。本專利技術涉及一種用于熱透化小球藻屬微藻生物質的方法，該方法以從微藻生物質中回收尤其富含肽和多肽并且富含寡糖的可溶性部分的方式進行。更確切地，根據本專利技術所述的方法是一種用于從小球藻屬微藻生物質制備分離蛋白的方法，該方法包括以下步驟：-提供一種由發酵產生的微藻生物質，-任選地，洗滌該生物質，以便消除間質可溶性化合物，-在50℃和150℃之間，優選在100℃和150℃之間的溫度下將該生物質熱透化，持續時間在10秒和5分鐘之間，優選持續時間在10秒和1分鐘之間，-將以此方式透化的生物質通過選自下組的固液分離技術進行消除，該組由以下各項組成：正向過濾或切向過濾、絮凝和離心，更具體地，多級離心，以獲得可溶性部分，-任選地，將以此方式獲得的可溶性部分通過微孔過濾進行回收和澄清，以便從中除去殘余不溶性物質，-在具有小于5kDa，優選在1kDa和5kDa之間的截止閾值的膜上對該可溶性部分(澄清的或未澄清的，取決于是否分別進行了前述回收和澄清的步驟)進行超濾，以便獲得可溶性分離蛋白，然后-將所述分離蛋白蒸發、巴氏滅菌并霧化。微藻的選擇優選地，小球藻屬微藻選自由普通小球藻、根腐小球藻和原殼小球藻組成的組，并且更具體地是原殼小球藻。在一個具體實施例中，該菌株為原殼小球藻(菌株UTEX250-美國得克薩斯大學奧斯汀分校藻類培養物保藏中心(TheCultureCollectionofAlgaeattheUniversityofTexasatAustin-USA))。在另一個具體實施例中，該菌株為耐熱性小球藻(菌株UTEX1663-美國得克薩斯大學奧斯汀分校藻類培養物保藏中心(TheCultureCollectionofAlgaeattheUniversityofTexasatAustin-USA))。在異養條件下并且在不存在光的情況下進行培養通常導致產生具有按干細胞的重量計，45％至70％的蛋白含量(通過測量氮含量N×6.25進行評估)的小球藻生物質。如將在下文示例，分兩個步驟進行這本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于從小球藻屬微藻生物質制備分離蛋白的方法，其特征在于它包括以下步驟：?提供一種由發酵產生的微藻生物質，?任選地，洗滌該生物質，以便消除間質可溶性化合物，?在50℃和150℃之間，優選在100℃和150℃之間的溫度下將該生物質熱透化，持續時間在10秒和5分鐘之間，優選持續時間在10秒和1分鐘之間，?將以此方式透化的生物質通過選自下組的固液分離技術進行消除，該組由以下各項組成：正向過濾或切向過濾、絮凝和離心，更具體地，多級離心，以獲得一種可溶性部分，?任選地，將以此方式獲得的可溶性部分通過微孔過濾進行回收和澄清，以便從中除去殘余不溶性物質，?在具有小于5kDa，優選在1kDa和5kDa之間的截止閾值的膜上對該可溶性部分進行超濾，以便獲得一種可溶性分離蛋白，然后?將所述分離蛋白蒸發、巴氏滅菌并霧化。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.07.18 FR 14569441.一種用于從小球藻屬微藻生物質制備分離蛋白的方法，其特征在于它包括以下步驟：-提供一種由發酵產生的微藻生物質，-任選地，洗滌該生物質，以便消除間質可溶性化合物，-在50℃和150℃之間，優選在100℃和150℃之間的溫度下將該生物質熱透化，持續時間在10秒和5分鐘之間，優選持續時間在10秒和1分鐘之間，-將以此方式透化的生物質通過選自下組的固液分離技術進行消除，該組由以下各...

【專利技術屬性】
技術研發人員：S·帕蒂尼爾，
申請(專利權)人：羅蓋特公司，
類型：發明
國別省市：法國;FR