合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株及構建方法技術

本發明專利技術公開了合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株及構建方法，合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株含有截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因、2,3-氧化鯊烯合成酶基因、截短C端45個氨基酸殘基的擬南芥中細胞色素-NADPH-還原酶1基因和達瑪烯二醇合成酶基因。本發明專利技術成功構建了合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株。與其他宿主菌相比，大腸桿菌合成達瑪烯二醇的途徑調控簡單，易于進行代謝工程改造，為達瑪烷型皂苷的大腸桿菌發酵生產奠定了基礎。

【技術實現步驟摘要】
合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株及構建方法
本專利技術屬于生物
，具體一種合成達瑪烯二醇的大腸桿菌工程菌及構建方法。
技術介紹
人參作為一種名貴中藥材，在疾病治療和在保健方面，一直都是研究和應用熱點。人參皂苷是一類三萜類化合物，是人參中的有效活性成分，根據三萜皂苷元的不同可分為達瑪烷型皂苷、齊墩果烷型皂苷。其中達瑪烷型人參皂苷如Rb1，Rg3，Rh2，CK以及皂苷元原人參二醇，具有保護心血管，抗疲勞，抗衰老，抗癌，保肝和增強免疫力的藥理作用。人參皂苷的傳統生產主要原材料為人參。到目前為止，我國野生人參資源已經瀕臨滅絕，人參種植易受病蟲害的影響，人參產品面臨高農殘的問題，嚴重影響我國人參類相關產品的品質。近年來，隨著人參皂苷合成途徑的逐漸解析，鯊烯合成酶、2,3-氧化鯊烯合成酶、達瑪烯二醇合成酶、原人參二醇合成酶、糖基轉移酶等一系列人參皂苷合成途徑關鍵基因的成功挖掘，利用微生物從頭生產原人參二醇、Rh2、CK和Rg3的報道逐漸出現。但是這些報道均采用酵母作為底盤細胞，由于酵母內源的麥角甾醇合成途徑調控復雜，為工程化改造帶來困難。大腸桿菌是微生物研究和應用的模式微生物，發酵操作和基因操作成熟。目前，大腸桿菌已成功用于類胡蘿卜素、紫杉醇、青蒿酸等藥物前體的生物合成，但還沒有生物合成達瑪烯二醇的報道。達瑪烯二醇是達瑪烷型人參皂苷的關鍵前體化合物。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術中的不足，提供一種合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株。本專利技術的第二個目的是提供一種合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株的構建方法。本專利技術的第三個目的是提供第二種合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株。本專利技術的第四個目的是提供第二種合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株的構建方法。本專利技術的第五個目的是提供三種合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株。本專利技術的第六個目的是提供三種合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株的構建方法。本專利技術的第七個目的是提供四種合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株。本專利技術的第八個目的是提供四種合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株的構建方法。本專利技術的技術方案概述如下：一種合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株(菌株1)，所述它含有截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因、2,3-氧化鯊烯合成酶基因、截短C端45個氨基酸殘基的擬南芥中細胞色素-NADPH-還原酶1基因和達瑪烯二醇合成酶基因。合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株的構建方法，包括如下步驟：(1)將截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因插入大腸桿菌(Escherichiacoli)表達質粒pET28a(+)的XbaI和BamHI酶切位點得到質粒1；將2,3-氧化鯊烯合成酶基因插入到質粒1的BamHI和SacI酶切位點，得到質粒2；將截短C端45個氨基酸殘基的擬南芥中細胞色素-NADPH-還原酶1基因插入到質粒2的HindIII和XhoI酶切位點，得到質粒3；將達瑪烯二醇合成酶基因插入到質粒3的SacI和HindIII位點，得到質粒5；(2)將質粒5轉化進入大腸桿菌，得到合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株，命名為菌株1；所述截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因的序列以SEQIDNO.1所示；所述2,3-氧化鯊烯合成酶基因的序列以SEQIDNO.2所示；所述截短C端45個氨基酸殘基的擬南芥中細胞色素-NADPH-還原酶1基因序列以SEQIDNO.3所示；所述達瑪烯二醇合成酶基因序列以SEQIDNO.5所示。一種合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株(菌株3)，所述它含有截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因、2,3-氧化鯊烯合成酶基因、截短C端45個氨基酸殘基的擬南芥中細胞色素-NADPH-還原酶1基因、達瑪烯二醇合成酶基因、法尼基焦磷酸合成酶基因和異戊烯焦磷酸異構酶基因。合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株的構建方法，包括如下步驟：(1)將截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因插入大腸桿菌表達質粒pET28a(+)的XbaI和BamHI酶切位點得到質粒1；將2,3-氧化鯊烯合成酶基因插入到質粒1的BamHI和SacI酶切位點，得到質粒2；將截短C端45個氨基酸殘基的擬南芥中細胞色素-NADPH-還原酶1基因插入到質粒2的HindIII和XhoI酶切位點，得到質粒3；將達瑪烯二醇合成酶基因插入到質粒3的SacI和HindIII位點，得到質粒5；(2)將質粒5轉化進入大腸桿菌，得到合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株1；所述截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因的序列以SEQIDNO.1所示；所述2,3-氧化鯊烯合成酶基因的序列以SEQIDNO.2所示；所述截短C端45個氨基酸殘基的擬南芥中細胞色素-NADPH-還原酶1基因序列以SEQIDNO.3所示；所述達瑪烯二醇合成酶基因序列以SEQIDNO.5所示。(3)將法尼基焦磷酸合成酶基因插入到質粒pCDFDuet1的BamhI和SacI酶切位點，得到質粒7；將異戊烯焦磷酸異構酶基因插入到質粒7的SacI和HindIII酶切位點中，得到質粒8；將質粒8轉化到合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株1中，得到合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株，命名為菌株3；所述法尼基焦磷酸合成酶基因的序列以SEQIDNO.6所示；所述異戊烯焦磷酸異構酶基因的序列以SEQIDNO.7所示。一種合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株(2)，它含有截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因、2,3-氧化鯊烯合成酶基因、截短C端33個氨基酸殘基的釀酒酵母中細胞色素-NADPH-還原酶基因和達瑪烯二醇合成酶基因。合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株的構建方法，包括如下步驟：(1)將截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因插入大腸桿菌表達質粒pET28a(+)的XbaI和BamHI酶切位點得到質粒1；將2,3-氧化鯊烯合成酶基因插入到質粒1的BamHI和SacI酶切位點，得到質粒2；將截短C端33個氨基酸殘基的釀酒酵母中細胞色素-NADPH-還原酶基因插入到質粒2的HindIII和XhoI酶切位點，得到質粒4；將達瑪烯二醇合成酶基因插入到質粒4的SacI和HindIII位點，得到質粒6；(2)將質粒6轉化進入大腸桿菌，得到合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株，命名為菌株2；所述截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因的序列以SEQIDNO.1所示；所述2,3-氧化鯊烯合成酶基因的序列以SEQIDNO.2所示；所述截短C端33個氨基酸殘基的釀酒酵母中細胞色素-NADPH-還原酶基因序列以SEQIDNO.4所示；所述達瑪烯二醇合成酶基因序列以SEQIDNO.5所示。一種合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株(4)，所述它含有截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因、2,3-氧化鯊烯合成酶基因、截短C端33個氨基酸殘基的釀酒酵母中細胞色素-NADPH-還原酶基因、達瑪烯二醇合成酶基因、法尼基焦磷酸合成酶基因和異戊烯焦磷酸異構酶基因。合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株的構建方法，包括如下步驟：(1)將截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因插入大腸桿菌表達質粒pET28a(+)的XbaI和BamHI酶切位點得到質粒1；將2,3-氧本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株，其特征是所述它含有截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因、2,3?氧化鯊烯合成酶基因、截短C端45個氨基酸殘基的擬南芥中細胞色素?NADPH?還原酶1基因和達瑪烯二醇合成酶基因。

【技術特征摘要】
1.一種合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株，其特征是所述它含有截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因、2,3-氧化鯊烯合成酶基因、截短C端45個氨基酸殘基的擬南芥中細胞色素-NADPH-還原酶1基因和達瑪烯二醇合成酶基因；所述截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因的序列以SEQIDNO.1所示；所述2,3-氧化鯊烯合成酶基因的序列以SEQIDNO.2所示；所述截短C端45個氨基酸殘基的擬南芥中細胞色素-NADPH-還原酶1基因序列以SEQIDNO.3所示；所述達瑪烯二醇合成酶基因序列以SEQIDNO.5所示。2.權利要求1合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株的構建方法，其特征是包括如下步驟：(1)將截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因插入大腸桿菌表達質粒pET28a(+)的XbaI和BamHI酶切位點得到質粒1；將2,3-氧化鯊烯合成酶基因插入到質粒1的BamHI和SacI酶切位點，得到質粒2；將截短C端45個氨基酸殘基的擬南芥中細胞色素-NADPH-還原酶1基因插入到質粒2的HindIII和XhoI酶切位點，得到質粒3；將達瑪烯二醇合成酶基因插入到質粒3的SacI和HindIII位點，得到質粒5；(2)將質粒5轉化進入大腸桿菌，得到合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株，命名為菌株1；所述截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因的序列以SEQIDNO.1所示；所述2,3-氧化鯊烯合成酶基因的序列以SEQIDNO.2所示；所述截短C端45個氨基酸殘基的擬南芥中細胞色素-NADPH-還原酶1基因序列以SEQIDNO.3所示；所述達瑪烯二醇合成酶基因序列以SEQIDNO.5所示。3.一種合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株，其特征是所述它含有截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因、2,3-氧化鯊烯合成酶基因、截短C端45個氨基酸殘基的擬南芥中細胞色素-NADPH-還原酶1基因、達瑪烯二醇合成酶基因、法尼基焦磷酸合成酶基因和異戊烯焦磷酸異構酶基因；所述截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因的序列以SEQIDNO.1所示；所述2,3-氧化鯊烯合成酶基因的序列以SEQIDNO.2所示；所述截短C端45個氨基酸殘基的擬南芥中細胞色素-NADPH-還原酶1基因序列以SEQIDNO.3所示；所述達瑪烯二醇合成酶基因序列以SEQIDNO.5所示；所述法尼基焦磷酸合成酶基因的序列以SEQIDNO.6所示；所述異戊烯焦磷酸異構酶基因的序列以SEQIDNO.7所示。4.權利要求3合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株的構建方法，其特征是包括如下步驟：(1)將截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因插入大腸桿菌表達質粒pET28a(+)的XbaI和BamHI酶切位點得到質粒1；將2,3-氧化鯊烯合成酶基因插入到質粒1的BamHI和SacI酶切位點，得到質粒2；將截短C端45個氨基酸殘基的擬南芥中細胞色素-NADPH-還原酶1基因插入到質粒2的HindIII和XhoI酶切位點，得到質粒3；將達瑪烯二醇合成酶基因插入到質粒3的SacI和HindIII位點，得到質粒5；(2)將質粒5轉化進入大腸桿菌，得到合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株1；所述截短C端26個氨基酸殘基的鯊烯合成酶基因的序列以SEQIDNO.1所示；所述2,3-氧化鯊烯合成酶基因的序列以SEQIDNO.2所示；所述截短C端45個氨基酸殘基的擬南芥中細胞色素-NADPH-還原酶1基因序列以SEQIDNO.3所示；所述達瑪烯二醇合成酶基因序列以SEQIDNO.5所示；(3)將法尼基焦磷酸合成酶基因插入到質粒pCDFDuet1的BamhI和SacI酶切位點，得到質粒7；將異戊烯焦磷酸異構酶基因插入到質粒7的SacI和HindIII酶切位點中，得到質粒8；將質粒8轉化到合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株1中，得到合成達瑪烯二醇的大腸桿菌基因工程菌株，命名為菌株3；所述法尼基焦磷酸合成酶基因的序列以SEQIDNO.6所示；所述異戊烯焦磷酸異構酶基因的序列以SEQIDNO.7所示。...

【專利技術屬性】
技術研發人員：盧文玉，李大帥，張強，趙方龍，
申請(專利權)人：天津大學，
類型：發明
國別省市：天津;12