本發明專利技術公開了本發明專利技術提供一株具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌，分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)BL21，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期：2016年05月，保藏號為CGMCC?No.7.239。所述的重組大腸桿菌為將氰水合酶基因與表達載體連接，然后將該載體轉入大腸桿菌(Escherichia?coli)中得到重組菌株。本發明專利技術提供的大腸桿菌，可以合成大量高效可溶性表達的氰水合酶，為合成氰水合酶提供了另一條途徑；本發明專利技術所得氰水合酶純度高，用于降解無機氰化物效果佳，具有極高的降解率。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一株重組大腸桿菌及其應用，特別涉及一株具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌及其應用。
技術介紹
氰在工業生產中應用較廣，產生的含氰廢水所造成的環境污染急需治理。生物法處理含氰廢水具有轉化產物無毒無害、不易發生二次污染，建設和運行成本較低，能處理金屬絡合氰化物等優勢。在自然界中超過2000種植物以及一些微生物能產生氰或利用氰。另一方面，氰化氫(HCN)是一種弱酸(pKa＝9.2)，在酸性或中性條件下易形成揮發性HCN，從而可能造成空氣污染。而且氰本身對微生物具有毒性，因此從實際應用角度看，只有在高堿性下具有氰耐受性的菌株才有工業應用價值。從目前國內外的研究情況看來，能在堿性條件下降解無機氰化物的菌種并不多，而能耐受高濃度氰的菌種則更少。與細胞降解相比，利用酶作催化劑處理環境污染物具有反應速度快、效率高、條件溫和、能耗低、操作簡便等優點，因此酶治理環境污染具有廣闊的應用前景。根據目前研究，氰水合酶(cyanide hydratase)和氰水解酶(cyanidase/cyanide dihydratase)是兩種較為重要的無機氰降解酶。但是從野生菌株中無法獲得大量的降解酶，限制了酶在氰方面的降解。目前Watanabe等從Pseudomonas stutzeri AK61中克隆出氰水解酶cyanidase的基因并成功在大腸桿菌中表達，Jandhyala等也成功克隆和表達了來自Bacillus pumilus C1的氰水解酶基因cynD。國內關于降氰酶的克隆研究報道僅見于喬琳等對一株能以氰化物為唯一碳氮源的銅綠假單胞細菌Pseudomonas aeruginosa KT-C001所產的氰水合酶基因(cya-1)進行了克隆和活性表達的研究，發現 cya-1的表達需要氰化物的誘導。公開于該
技術介紹
部分的信息僅僅旨在增加對本專利技術的總體背景的理解，而不應當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現有技術。
技術實現思路
本專利技術提供一株具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌，分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期：2016年05月10日，保藏號為CGMCC No.7.239；所述的重組大腸桿菌為將氰水合酶基因與表達載體連接，然后將該載體轉入大腸桿菌(Escherichia coli)中得到重組菌株。其中，所述的氰水合酶基因來源于產堿桿菌(Alcaligenes sp.)DN25；所述的大腸桿菌為大腸桿菌(Escherichia coli)BL21，即E.coli BL21。其中，所述的氰水合酶基因序列如SEQ ID NO.1所示。一株具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌的構建方法，包含以下操作步驟：(1)將氰水合酶基因連接到表達載體相應的多克隆位點上；(2)將步驟(1)中所得表達載體導入大腸桿菌中，即得。其更詳細的步驟為：(1)將經聚合酶鏈式反應(PCR)獲得的氰水合酶目的基因連接到表達載體相應的多克隆位點上，并轉入大腸桿菌DH5α內，經測序驗證獲得正確的重組質粒；(2)利用熱激法將步驟(1)中所得重組質粒導入大腸桿菌BL21內，即得重組菌株。其中，步驟(1)中所述的表達載體為pET28a。一株具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌，通過誘導劑誘導重組大腸桿菌，可實現目標氰水合酶的高效表達，獲得可溶性好及活性高的氰水合酶蛋白，分子量約為38kDa；其誘導條件為OD600為0.6，溫度為28℃，誘導劑濃度為0.3mM，誘導時間為12小時；其中，所述的誘導劑為異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。其中，上述所得具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌用于對氰化物進行降解，降解反應為在pH值為8.0的磷酸緩沖液中，保持溫度為30℃，反應50分鐘，氰化物完全被降解。其中，大腸桿菌內所得氰水合酶利用鎳柱親和層析進行純化，即依次使用含濃度為10mM、100mM咪唑的緩沖液洗脫，最后經濃度為500mM的咪唑洗脫可獲得氰水合酶，純度達95％以上。其中，上述所得純化的氰水合酶用于氰化物降解。其中，利用純化的氰水合酶降解氰化物時，降解反應為在pH值為8.0的磷酸緩沖液中，保持溫度為30℃，反應50分鐘，氰化物完全被降解。與現有技術相比，本專利技術具有如下有益效果：1)本專利技術提供的大腸桿菌，可以合成大量高效可溶性表達的氰水合酶，為合成氰水合酶提供了另一條途徑；2)本專利技術所得氰水合酶純度高，用于降解無機氰化物效果佳，具有極高的降解率。附圖說明圖1本專利技術菌株構建流程圖。圖2本專利技術菌株的發酵產酶。圖3本專利技術菌株的最佳pH和溫度。圖4本專利技術菌株的分離純化電泳圖譜。圖5本專利技術所得氰水合酶水解氰化鉀的實驗結果。具體實施方式下面結合附圖具體實施方式進行詳細描述，但應當理解本專利技術的保護范圍并不受具體實施方式的限制。實施例11.具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌的構建：1)用引物1：5`-GCCCATATGATGGCGCATTACCCTAAATTC-3`(SEQ ID NO.2)，引物2：5`-TTCAAGCTTTTACTTCCGCAAGCTCCGAAC-3`(SEQ ID NO.3)對Alcaligenes sp.DN25(Alcaligenes sp.DN25保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC NO.5734)基因組進行PCR擴增，反應條件如表1所示：表1其中，步驟(2)進行30個循環，即得目的基因氰水合酶基因，基因序列如SEQ ID NO.1所示；2)用限制性內切酶Hind III和NdeI對所得氰水合酶目的基因和表達載體pET28a在37℃下酶切8h；3)在16℃下用T4連接酶將酶切后的氰水合酶目的基因和表達載體 pET28a連接10h，并轉入大腸桿菌DH5α內，經測序驗證獲得正確的重組質粒，用熱激法將所得重組質粒轉入表達菌株E.coli BL21(即Escherichia coli BL21)，并涂布于50μg/mL卡納霉素抗性平板培養12h；4)用菌落PCR和雙酶切從平板篩選陽性克隆并經測序驗證，對構建成功的重組菌進行誘導表達12h，經蛋白電泳確定目的蛋白條帶為38kDa，可溶性良好。2.具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌的誘導發酵產酶將重組大腸桿菌種子液接種于含1‰卡那霉素的新鮮培養基中，在37℃，180rpm下培養至OD600為0.6，加入誘導劑IPTG濃度為0.3mM，再于28℃，180rpm的恒溫搖床中培養12h。3.氰水合酶蛋白分離純化用Binding buffer(10mM咪唑，500mM NaCl，20mM Tris-HCl,pH 8)重懸菌體，利用高壓勻漿機(800bar～1000bar)破碎菌體并以4℃、9000rpm和離心30min獲取粗酶液；將粗酶液過先用Binding buffer平衡的鎳柱，使用Binding buffer洗掉非目標蛋白，再用Elution buffer A(100mM咪唑，500mM NaCl，20mM Tris-HCl,pH 8)進一步洗脫，最后用Elution buffer(500mM咪唑，500mM Na本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一株具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌，其特征在于：將氰水合酶基因與表達載體連接，然后將該載體轉入大腸桿菌(Escherichia?coli)中得到重組菌株。
【技術特征摘要】
1.一株具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌，其特征在于：將氰水合酶基因與表達載體連接，然后將該載體轉入大腸桿菌(Escherichia coli)中得到重組菌株。2.根據權利要求1所述具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌，其特征在于：所述的氰水合酶基因來源于產堿桿菌(Alcaligenes sp.)DN25；所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21。3.根據權利要求1所述具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌，其特征在于：所述的氰水合酶基因序列如SEQ ID NO.1所示。4.一株如權利要求1所述的具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌的構建方法，包含以下操作步驟：(1)將氰水合酶基因連接到表達載體相應的多克隆位點上；(2)將步驟(1)中所得表達載體導入大腸桿菌中，即得。5.根據權利要求1所述具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌的構建方法，其特征在于：步驟(1)中所述的表達載體為pET28a。6.一株如權利要求1所述的具有高表達氰水合酶的重組大腸桿菌的誘導發酵產...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李青云，劉幽燕，梁文思，
申請(專利權)人：廣西大學，廣西南寧明科環?？萍加邢薰?/a>，
類型：發明
國別省市：廣西;45
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