本發明專利技術提供了一種ZFNs介導的牛MSTN基因敲除和定點整合外源基因的方法，根據牛肌肉抑制素基因序列，設計ZFNs特異位點表達載體，并根據ZFNs作用位點設計含有外源基因的且可以整合至宿主基因組中的打靶載體，然后將上述表達載體和打靶載體共同轉入牛的成纖維細胞中，獲得牛肌肉抑制素基因敲除且定點整合外源基因的細胞；其中，設計特異的鋅指蛋白核酸酶ZFNs，其作用的DNA序列位于牛MSTN基因的外顯子上。本發明專利技術構建的鋅指核酶介導的打靶載體為牛MSTN基因敲除和外源基因的定點插入提供了一種簡便快速的途徑，對“雙肌”肉牛新品種的遺傳育種具有重要價值。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物學領域，具體地說，涉及一種。
技術介紹
肌肉生成抑制素(MSTN)屬于TGF-P超家族，是骨骼肌生長發育的負調控因子，其活性的喪失或降低，會造成動物肌肉的過度發育，而形成“雙肌”(double muscle).自然界中有多種動物都有這種雙肌現象，包括豬、狗、牛，甚至人也有這種性狀出現。在自然選育的牲畜中，比利時藍牛(Belgian Blue)和皮埃蒙特牛(piedmontese)是典型的雙肌動物。二者都是由MSTN基因發生突變造成的，前者為MSTN序列第三個外顯子中缺失了 Ilbp核苷酸，造成MSTN閱讀框發生突變，產生的MSTN蛋白不能夠發揮其生物活性；后者則在第一個外顯子和第三個外顯子中都發生了突變，其突變類型為堿基替換，使翻譯出的MSTN蛋白中一個亮氨酸突變為苯丙氨酸，一個半胱氨酸突變為酪氨酸，最終造成了 MSTN蛋白失活(Kambadur, Sharma等，1997)。MSTN基因的發現為生物育種工作提供了新的思路。1997年McPherron等人獲得了 MSTN基因敲除的小鼠模型，并且發現同齡的該小鼠比野生型小鼠在體重上增加30%,而且在成年鼠中，該表型不受年齡和性別的影響(McPherron, Lawler等，1997)。目前，國內肉牛品種中缺乏這種“雙肌”的品種，如果能夠獲得這種MSTN突變型的肉牛品種，則能夠提高我國的肉牛品質，增加肉牛飼養的收益。通過常規育種方式能夠獲得MSTN突變型肉牛，但是該技術選育速度慢，性狀遺傳不穩定。基因打靶技術是近年來發展起來的一種對細胞遺傳信息進行修飾、修改，或者將外源基因導入的轉基因技術，獲得基因打靶的細胞后，再通過體細胞核移植技術和胚胎移植技術，可以最終獲得轉基因動物個體。這種`方法能夠在一到兩個代次內獲得具有穩定遺傳性狀的個體，大大提高了動物改良和選育的速度。傳統的基因打靶技術效率約10_7，效率較低，并且需要經過多種手段的篩選，最終得到的細胞代次高，細胞狀態差。近年來，研究者將特異性識別DNA序列的鋅指結構(Zinc finger)與非特異性切割DNA鏈的核酸酶相結合,開發出了能夠對基因組的某一特異性位點識別并切割的鋅指核酶(Zinc finger nuclease)。由鋅指核酶介導的基因剪切具有較高的效率，能夠達到10_2的水平，并且鋅指核酶介導的同源重組效率高于傳統的打靶技術。目前，該技術被廣泛應用于植物、線蟲、魚、鳥類，以及哺乳動物細胞的基因修飾和轉基因的實驗研究中。而在針對牛MSTN基因的敲除和打靶上尚未有報道。魚油里的長鏈不飽和脂肪酸《-3已經被證實有益于人類健康。動物肉類產品中包含有少量的食物(谷物)來源的《_3和大量的《 _6，高含量的《-6是導致冠狀動脈硬化、癌癥、糖尿病、關節炎以及抑郁癥發生的主要原因之一。家畜體內由于缺少脂肪酸去飽和酶基因而不能將《_6轉化成《_3，而低等動物線蟲中具有行使這種轉化功能的fat-1基因。將線蟲fat-1基因經人源化修飾后的hfat-1基因，轉入小鼠和豬，結果轉基因小鼠和豬的肌肉里，《_3與《-6的比率可以提高至5倍。最近，有報道稱成功培育了 fat-1轉基因奶牛，但fat-1轉基因肉牛的研究上未見報道。利用鋅指核酶敲除肉牛MSTN基因，同時在鋅指核酶切割位點定點整合hfat-1基因的研究未見報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種ZFNs介導的牛MSTN基因敲除和定點整合外源基因(如hfat-1基因)的方法。為了實現本專利技術目的，本專利技術的一種，其是根據牛肌肉抑制素基因序列，設計ZFNs特異位點表達載體，并根據ZFNs作用位點設計含有外源基因的且可以整合至宿主基因組中的打靶載體，然后將上述表達載體和打靶載體共同轉入牛的成纖維細胞中，獲得牛肌肉抑制素基因敲除且定點整合外源基因的細胞；其中，設計特異的鋅指蛋白核酸酶ZFNs，其作用的DNA序列位于牛MSTN基因的外顯子上。前述的方法，ZFNs作用的DNA序列優選位于牛MSTN基因的第2外顯子和/或第3外顯子上。前述的方法，ZFNs作用的 DNA 序列為:CTCATCAAACCCATGAAAGACGGTACAAGGTATACTGG 和 / 或 TTCCCAGAACCAGGAGAAGATGGACTGGTA。前述的方法，所述打靶載體含有根據ZFNs作用位點設計的牛MSTN基因5’同源臂和3’同源臂。 前述的方法 ，所述外源基因為脂肪酸去飽和酶fat-1基因，或fat-1基因經過人源化修飾后的基因(hfat-1基因)。前述方法包括如下步驟:方案1:I)構建bZFN-1和bZFN-2表達載體，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2 所示；2)根據ZFNs作用位點構建含有外源基因的且可以整合至宿主基因組中的打靶載體pflrk-1,其堿基序列如SEQ ID NO: 5所示；3)將上述表達載體和打靶載體共同轉入牛的成纖維細胞中，通過PCR產物測序檢測牛肌肉抑制素基因敲除且定點整合外源基因的細胞；和/或方案I1:I)構建bZFN-3和bZFN-4表達載體，它們的堿基序列分別如SEQ ID N0:3和SEQID NO:4 所示；2)根據ZFNs作用位點構建含有外源基因的且可以整合至宿主基因組中的打靶載體pflrk-2,其堿基序列如SEQ ID N0:6所示；3)將上述表達載體和打靶載體共同轉入牛的成纖維細胞中，通過PCR產物測序檢測牛肌肉抑制素基因敲除且定點整合外源基因的細胞。本專利技術還提供根據上述方法獲得的牛肌肉抑制素基因敲除且定點整合外源基因的細胞。本專利技術還提供上述方法在生產牛MSTN基因敲除且定點整合外源基因的克隆牛中的應用。本專利技術還提供一種制備牛MSTN基因敲除且定點整合外源基因的牛克隆胚胎的方法，其以上述牛肌肉抑制素基因敲除且定點整合外源基因的細胞為核移植供體細胞，離體的卵母細胞為核移植受體細胞，通過核移植技術獲得牛克隆胚胎。本專利技術還提供一種制備轉基因牛的方法，其是將通過上述方法制備的克隆胚胎通過非手術法移入牛子宮內進行妊娠，獲得轉基因牛。具體地，本專利技術是從GenBank中獲得MSTN全長DNA序列，針對第二外顯子設計兩套鋅指核酶載體，分別命名為bMK-1和bMK-1I，其中bMK-1包括bZFN_l、bZFN_2兩個質粒，bMK-1I包括bZFN-3和bZFN-4兩個質粒(由Sigma-Aldrich公司完成)，通過脂質體共轉染的方法，將兩套鋅指核酶載體分別導入不同的牛胎兒成纖維細胞中，再挑取單細胞建立多個單細胞株，將同一細胞株分為兩部分，分別傳代和凍存，對傳代的細胞株提取基因組，使用跨作用位點的PCR檢測引物進行擴增，擴增產物進行測序鑒定，最終得到在鋅指核酶作用位點發生突變細胞株。從牛成纖維細胞獲得基因組DNA，根據GenBank中報道的MSTN全長序列，分別設計針對鋅指核酶作用位點的同源臂引物，通過PCR擴增出同源臂，通過連接克隆載體并進行限制酶切和測序鑒定為正確序列后，采用酶切和連接的方法將5’同源臂和3’同源臂分別連接到基礎載體pCAGG-hfat-1-BGHpA的預期位置，最后通過限制酶酶切鑒定同源臂的正確性，最終獲得針對bMK-1作用位點的打靶載體pflrk-1和針對bMK-1I作用位點的打靶本文檔來自技高網...
【技術保護點】
ZFNs介導的牛MSTN基因敲除和定點整合外源基因的方法，其特征在于，其是根據牛肌肉抑制素基因序列，設計ZFNs特異位點表達載體，并根據ZFNs作用位點設計含有外源基因的且可以整合至宿主基因組中的打靶載體，然后將上述表達載體和打靶載體共同轉入牛的成纖維細胞中，獲得牛肌肉抑制素基因敲除且定點整合外源基因的細胞；其中，設計特異的鋅指蛋白核酸酶ZFNs，其作用的DNA序列位于牛MSTN基因的外顯子上。
【技術特征摘要】
1.FNs介導的牛MSTN基因敲除和定點整合外源基因的方法，其特征在于，其是根據牛肌肉抑制素基因序列，設計ZFNs特異位點表達載體，并根據ZFNs作用位點設計含有外源基因的且可以整合至宿主基因組中的打靶載體，然后將上述表達載體和打靶載體共同轉入牛的成纖維細胞中，獲得牛肌肉抑制素基因敲除且定點整合外源基因的細胞；其中，設計特異的鋅指蛋白核酸酶ZFNs，其作用的DNA序列位于牛MSTN基因的外顯子上。2.據權利要求1所述的方法，其特征在于，ZFNs作用的DNA序列位于牛MSTN基因的第2外顯子和/或第3外顯子上。3.據權利要求2所述的方法，其特征在于，ZFNs作用的DNA序列為:CTCATCAAACCCATGAAAGACGGTACAAGGTATACTGG 和 / 或 TTCCCAGAACCAGGAGAAGATGGACTGGTA。4.據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述打靶載體含有根據ZFNs作用位點設計的牛MSTN基因5’同源臂和3’同源臂。5.據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，所述外源基因為脂肪酸去飽和酶fat-1基因，或fat-1基因經過人源化修飾后的基因。6.據權利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步驟: 方案1: 1)構建bZFN-1和bZFN-2表達載體，它們的堿基序列分別如SEQID NO:1和SEQ IDN0:2...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李榮鳳，李雪玲，趙宇航，云亭，梁浩，
申請(專利權)人：內蒙古大學，
類型：發明
國別省市：
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