本發明專利技術涉及基因工程領域，特別涉及一種由噬菌體PhiX174突變裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA組成的高效裂解串聯基因，基因序列如序列表中序列3所示。含有上述高效裂解串聯基因的高效裂解質粒。高效裂解質粒在制備菌蛻中的應用。本發明專利技術構建的安全高效的裂解質粒pBV-mELS能夠在大腸桿菌菌液OD600值達到1.0以上時進行誘導，裂解效率可到達99.99995%，不僅突破了裂解基因E介導的裂解過程依賴宿主細菌生長狀態（OD600為0.4～0.6）的局限性，大大提高了菌蛻的產量，還能夠有效清除菌蛻中殘存的遺產物質，降低了危害性遺傳元件（抗生素抗性基因和病原決定簇基因）的側向傳播。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程領域，特別涉及一種由噬菌體PhiX174突變裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA組成的聞效裂解串聯基因，含有此聞效裂解串聯基因的聞效裂解質粒及構建方法，還涉及所述高效裂解質粒在制備菌蛻中的應用。
技術介紹
細菌菌蛻(Bacterial Ghosts, BGs)是革蘭氏陰性菌被噬菌體PhiX174的裂解蛋白E裂解后形成的完整的細菌空殼。裂解蛋白E是由91個氨基酸組成的疏水跨膜蛋白，其本身不具有任何酶的活性，但可通過寡聚化介導跨膜孔道的形成。孔道形成后，在細胞內高滲透壓的作用下革蘭氏陰性菌的大部分胞質內容物由孔道排出，從而形成不含核酸、核糖體及其它組分的細菌空殼。這種非變性的基因滅活方式使菌蛻完好地保留了細菌的各種表面抗原成分和免疫粘附分子。因此，菌蛻不僅可以直接作為疫苗使用，而且還可作為遞呈異源抗原的重組疫苗及作為核酸疫苗甚至藥物的遞送載體。細菌菌蛻的形成是通過對裂解基因E的嚴格表達調控實現的，應用最廣泛的是入pL/pR-cI857溫控表達系統。基因E的溫控表達介導的細菌裂解已經成功地應用于很多革蘭氏陰性菌，例如:大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺旋桿菌、胸膜肺炎放射桿菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯氏菌、巴氏桿菌、鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、愛德華菌等。因此，推測只要將基因E裂解框引入到合適的載體中，E蛋白介導的裂解可能會在每種革蘭氏陰性菌中發生。然而，E蛋白介導的裂解過程依賴于宿主細菌的生長狀態，要求宿主細菌處于對數生長中期，OD600值在0.2 0.6之間，這致使菌蛻的產量偏低，限制了菌蛻的大規模生產。即使宿主細菌處于對數生長中期，E蛋白介導的裂解過程并不能使所有細菌失活。有研究應用流式細胞術監控大腸桿菌菌蛻的形成，在菌蛻制劑中未裂解的可繁殖細胞最低比率也達到1%，還存在約4%裂解 不完全的失活細胞。在這些未裂解和裂解不完全的失活細胞中存在著大量的細菌遺傳物質，使菌蛻存在著病原決定簇基因或抗生素基因側向傳播的風險。菌蛻要作為疫苗或分子遞送載體使用，必須克服裂解效率低、產量低及菌蛻中存在的不安全因素等難題。因此，本領域需要更為安全、高效的裂解質粒，并應用該質粒制備安全的菌蛻制劑。
技術實現思路
針對上述
技術介紹
中提到的裂解效率低、產量低及菌蛻中存在的不安全因素等問題，本專利技術提供了一種由噬菌體PhiX174突變裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA組成的聞效裂解串聯基因，含有此聞效裂解串聯基因的聞效裂解質粒及構建方法。本專利技術還提供了所述高效裂解質粒在制備菌蛻中的應用。本專利技術是通過以下方式實現的: 一種由噬菌體PhiX174突變裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA組成的高效裂解串聯基因，基因序列如序列表中序列3所不。含有上述所述的聞效裂解串聯基因的聞效裂解質粒。所述的高效裂解質粒，將所述的高效裂解串聯基因酶切后插入PBV220載體中。所述的高效裂解質粒的構建方法，包括以下步驟: (1)以噬菌體PhiX174RFI DNA為模板、以序列表中的序列4和序列5為引物進行PCR擴增，獲得突變裂解基因E ; (2)以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板、序列表中序列6和序列7為引物進行PCR擴增，獲得葡萄球菌核酸酶A基因； (3)將步驟(I)中得到的突變裂解基因E和步驟(2)中得到的葡萄球菌核酸酶A基因作為下一步PCR反應的模板，用序列表中的序列4和序列7進行擴增，得到串聯基因； (4)將串聯基因應用I和I限制性內切酶進行雙酶切，酶切產物與經I和Sall雙酶切的pBV220載體連接，得到高效裂解質粒。將步驟(4)得到的高效裂解質粒轉化大腸桿菌DH5CI感受態細胞，30°C過夜培養16 h，挑取單菌落于氨芐青霉素抗性的LB培養基中30°C過夜振蕩培養，提取質粒，保留鑒定為陽性的質粒。所述的高效裂解質粒在制備菌蛻中的應用。所述的菌蛻優選為腸桿菌科的菌蛻。所述的應用，包括以下步驟: (1)將含有高效裂解質粒的大腸桿菌DH5α在30°C培養至OD6tltl值達到1.0-1.2 ； (2)培養溫度升高至42°C誘導高效裂解串聯基因的表達； (3)在升溫誘導90min時添加終濃度為IOmM的CaCl2和I mM的MgCl2，來激活SNA的活性； (4)升溫誘導4h時，收集步驟(3)獲得的菌蛻，洗滌后保存。有益效果:本專利技術構建的安全高效的裂解質粒pBV-mELS能夠在大腸桿菌菌液0D_值達到1.0以上時進行誘導，裂解效率可到達99.99995%，不僅突破了裂解基因E介導的裂解過程依賴宿主細菌生長狀態(OD6c 為0.4 0.6)的局限性，大大提高了菌蛻的產量，還能夠有效清除菌蛻中殘存的遺產物質，降低了危害性遺傳元件(抗生素抗性基因和病原決定族基因)的側向傳播。附圖說明附圖1本專利技術構建的安全高效的裂解質粒pBV-mELS的物理圖譜； 附圖2大腸桿菌DH5a (pBV-mELS)的裂解動力學曲線； 附圖3大腸桿菌DH5a (pBV-mELS)在裂解過程中菌體和上清中遺傳物質的定量分析； 附圖4大腸桿菌DH5a (pBV-mELS)在裂解過程中菌體和上清中遺傳物質的電泳分析， 其中A為菌體中基因組DNA，B為菌體中質粒DNA，C為培養物上清中DNA ； 附圖5大腸桿菌DH5a (pBV-mELS)菌蛻的掃描電鏡照片； 附圖6大腸桿菌DH5 a (pBV-mE)的裂解動力學曲線； 附圖7大腸桿菌DH5 a (pBV-mE)在裂解過程中菌體和上清中遺傳物質的定量分析； 附圖8大腸桿菌DH5 a (pBV-mE)在裂解過程中菌體和上清中遺傳物質的電泳分析， 其中自左至右依次為菌體中基 因組DNA、菌體中質粒DNA、培養物上清中DNA。具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步闡釋本專利技術，本專利技術構建的安全高效的裂解質粒PBV-mELS的結構特征和優勢將隨著描述而更為清晰。下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常規方法。實施例1、安全高效的裂解質粒pBV-mELS的構建 1.1噬菌體PhiX174突變裂解基因E的PCR擴增 根據GenBank中PhiX174 (GenBank N0.J02482.1)裂解基因E的編碼序列設計引物，通過將點突變引入引物，擴增突變裂解基因E (mE)。在引物mE-F的5’端引入I限制性酶切位點，在引物mE-R的5’端引入15個氨基酸(Gly4Ser) 3序列作為Linker,預計擴增片段長度為327 bp ο引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下: mE-F:5’ - GCGAATTCTGGTACGCTGGACTTTGTG -3’，(見序列表中序列 4)mE-R:5’_ GCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACC CTCCTTCCGCAC-3’，(見序列表中序列5) 以PhiX174 RFI DNA為模板通過PCR擴增突變裂解基因E。PCR反應體系為50 yL中，含 IOXDreamTaq Buffer (Mg2+ Plus) 5 μ L, dNTP Mixture 200 μ M, PhiX174 RFI DNA 2ng,mE_F 和 mE_R 各 0.8 μ Μ, Ferment本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種高效裂解串聯基因，其特征是基因序列如序列表中序列3所示。
【技術特征摘要】
1.一種聞效裂解串聯基因，其特征是基因序列如序列表中序列3所7]^。2.根據權利要求1所述的高效裂解串聯基因，其特征是由噬菌體PhiX174突變裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA串聯組成的。3.含有上述權利要求1或2所述的高效裂解串聯基因的高效裂解質粒。4.根據權利要求3所述的高效裂解質粒，其特征是將權利要求1或2所述的高效裂解串聯基因酶切插入PBV220載體中。5.一種權利要求3或4所述的高效裂解質粒的構建方法，其特征是包括以下步驟: (1)以噬菌體PhiX174RFI DNA為模板、以序列表中的序列4和序列5為引物進行PCR擴增，獲得突變裂解基因E ； (2)以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板、序列表中序列6和序列7為引物進行PCR擴增，獲得葡萄球菌核酸酶A基因； (3)將步驟(I)中得到的突變裂解基因E和步驟(2)中得到的葡萄球菌核酸酶A基因作為下一步PCR反應的模板，用序列表中的序列4和序列7進行擴增，得到串聯基因； (4)...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王金寶，張玉玉，吳家強，王可，杜以軍，李俊，于江，彭軍，
申請(專利權)人：山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，
類型：發明
國別省市：
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