一種抗菌重組多肽及其表達(dá)載體制造技術(shù)

一種抗菌重組多肽及其表達(dá)載體，解決了現(xiàn)有的通過人工合成蛋白肽的方法合成的Lactoferampin（Lfcin）和Lactoferampin（Lfampin）的一種嵌合結(jié)構(gòu)肽鏈（N-FKCRRWQWRMKKLG-K-RSKNKGFKEQAKSLLKWILD-N）存在的生產(chǎn)工藝繁瑣，成本昂貴，產(chǎn)量低，不適合規(guī)?；a(chǎn)問題。該抗菌重組多肽的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ?ID?NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ?ID?NO:2所示。本發(fā)明專利技術(shù)具有抑菌效果強(qiáng)，生產(chǎn)工藝簡單，成本低，產(chǎn)量高，適合規(guī)?；a(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及基因工程
，具體涉及一種抗菌重組多肽及其表達(dá)載體。
技術(shù)介紹
1928年，英國細(xì)菌學(xué)家弗萊明發(fā)現(xiàn)了青霉素，從此拉開了人類使用抗生素的序幕?？股刈允褂靡詠恚m然挽救了無數(shù)生命，但是抗生素具有一定的毒副作用，長期不規(guī)范使用很容易使菌、毒株產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)使機(jī)體免疫功能受到抑制，世界衛(wèi)生組織建議抗生素在醫(yī)院內(nèi)使用率不超過30%，而中國卻高達(dá)74%。近年來，抗生素不僅在疾病防治中大量使用，在食品、衛(wèi)生保健品和動(dòng)物飼料等方面也無限制使用，致使抗生素的使用效果逐年下降，一些抗藥的超級(jí)病菌、抗藥病毒不斷涌現(xiàn)，給疾病防治帶來極大困難，嚴(yán)重?fù)p害了人以及動(dòng)物的健康。目前，亞洲和歐洲都成為了耐藥性細(xì)菌的高發(fā)地區(qū)，而在我國三級(jí)醫(yī)院中，耐藥性細(xì)菌基本上是比較常見，發(fā)生率在30% 40%，甚至50%，從世衛(wèi)組織了解到，在中國診斷為結(jié)核病的病例當(dāng)中，有6.8%為耐藥結(jié)核，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大多數(shù)發(fā)達(dá)國家2%的比例，據(jù)統(tǒng)計(jì)資料顯示，我國每年有8萬人死于過度使用抗生素，7歲以下兒童因不合理使用抗生素造成耳聾的數(shù)量高達(dá)30萬人。在動(dòng)物疾病防治方面，僅以奶牛乳房炎為例，我國奶牛乳房炎呈陽性率為46.4% 85.7%，發(fā)病率為20% 70%，抗生素一直是治療奶牛乳房炎的重要手段，自從1945年試用青霉素治療奶牛乳房炎以來，因其療效顯著而使抗生素治療奶牛乳房炎得到了不斷的發(fā)展，但是，長期大量使用抗 生素不僅導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生，治療效果降低，同時(shí)抗生素還使奶牛免疫功能受到抑制，容易造成重復(fù)感染，更嚴(yán)重的是，耐藥性細(xì)菌還可以通過乳汁傳染給人，牛奶中殘留的抗生素也會(huì)誘發(fā)人體產(chǎn)生超敏反應(yīng)。人類正面臨失去這些寶貴藥物的危險(xiǎn)，而失去這些藥物的速度已經(jīng)超過替代藥物的開發(fā)速度，世界將進(jìn)入所謂的后抗生素時(shí)代，在合理使用抗生素的同時(shí)，研制安全、高效、不易產(chǎn)生抗藥性的新型藥物替代和輔助傳統(tǒng)抗生素成為新一代藥物研究的必然要求。乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)是一種鐵結(jié)合性糖蛋白，主要存在于哺乳動(dòng)物的各種外分泌物中，以乳汁特別是初乳中含量最高，具有廣譜的抗菌功能，抗菌機(jī)理有別于抗生素，不易產(chǎn)生抗藥性，應(yīng)用前景及市場潛力廣闊，越來越受到國內(nèi)及國外科研工作者的關(guān)注，但是乳鐵蛋白不能單獨(dú)作為抗菌藥物使用，如何增強(qiáng)其抗菌活性成為目前研究的熱點(diǎn)。Bolscher等通過人工合成蛋白肽的方法合成了 Lactoferampin (Lfcin)和Lactoferampin (Lfampin)的一種嵌合結(jié)構(gòu)肽鏈(N-FKCRRWQWRMKKLG-K-RSKNKGFKEQAKSLLKWILD-N),測得該種肽抗菌活性顯著高于Lactoferampin和Lactoferampin,甚至兩者混合物。合成方法是:采用Mill1-Gen 9050肽鏈合成儀，從賴氨酸(Lys)開始先合成LFcinl7-30肽鏈，到N端的苯丙氨酸(Phe)結(jié)束，再通過肼解作用將C末端賴氨酸(Lys)上的保護(hù)集團(tuán)(ivDde)釋放,繼續(xù)合成LFampin265-284肽鏈,通過這個(gè)方法合成的肽鏈含有一個(gè)C末端賴氨酸氨基化合物，兩個(gè)含N末端的肽鏈在C末端兩側(cè)，采用RP-HPLC進(jìn)行純化，收集到的肽采用離子肼質(zhì)譜(LCQ Deca XP)進(jìn)行分析檢驗(yàn)。現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn):生產(chǎn)工藝繁瑣，成本昂貴，產(chǎn)量低，不適合規(guī)?；a(chǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了解決現(xiàn)有的通過人工合成蛋白肽的方法合成的Lactoferampin (Lfcin)和Lactoferampin (Lfampin)的一種嵌合結(jié)構(gòu)肽鏈(N-FKCRRWQWRMKKLG-K-RSKNKGFKEQAKSLLKWILD-N)存在的生產(chǎn)工藝繁瑣，成本昂貴，產(chǎn)量低，不適合規(guī)?；a(chǎn)問題，本專利技術(shù)提供一種抗菌重組多肽及其表達(dá)載體。本專利技術(shù)為解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下:一種抗菌重組多肽，該抗菌重組多肽的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:2所示。所述抗菌重組多肽的表達(dá)量為0.23mg/ml 2.3mg/ml。的一種抗菌重組多肽的基因表達(dá)載體，該基因表達(dá)載體通過以下方法得到:合成抗菌重組多肽Lfa-AA-Lfc基因，將該基因與pGEM-T Easy Vector連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌C600感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆測序，將序列正確的抗菌重組多肽Lfa-AA-Lfc基因與巴斯德畢赤酵母分泌型表達(dá)載體PPIC9K通過T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌C600感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，經(jīng)酶切篩選出正確連接的重組質(zhì)粒pPIC9K-Lfa-AA-Lfc。所述重組質(zhì)粒pPIC9K-Lfa-AA_Lfc經(jīng)過線性化后，轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母菌中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物層析法純化。所述巴斯德畢赤酵母為畢赤酵母宿主菌GS115。本專利技術(shù)的有益效果是:乳鐵蛋白分子中的兩個(gè)抗菌活性部分Lactoferampin (Lfcin)和Lactoferampin(Lfampin)均位于分子的相似區(qū)域N端,本專利技術(shù)根據(jù)Lfcin和Lfampin兩個(gè)肽段在乳鐵蛋白中的二級(jí)結(jié)構(gòu)和空間排列狀態(tài)，利用生物軟件設(shè)計(jì)出抗菌重組多肽Lfa-AA-Lfc的氨基酸序列，并且合成了該抗菌重組多肽Lfa-AA-Lfc的基因序列，通過真核表達(dá)系統(tǒng)制備出一種具有熱穩(wěn)定、抗菌作用廣譜、藥效期長、相對(duì)分子質(zhì)量小的新型抗菌重組多肽Lfa-AA-Lfc，同時(shí)，由于乳鐵蛋白抗菌機(jī)理的特殊性，使得該抗菌重組多肽Lfa-AA-Lfc具有不易產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點(diǎn)，為新型抗菌藥物的研制打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，經(jīng)檢測抗菌重組多肽Lfa-AA-Lfc的表達(dá)量為0.23mg^2.3mg/ml，并且表達(dá)產(chǎn)物在培養(yǎng)基上清液中，因此可以推斷，這種廉價(jià)、簡便、高效的制備方法為抗菌重組多肽Lfa-AA-Lfc的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了條件，在實(shí)驗(yàn)室條件下?lián)u瓶培養(yǎng)就可以獲得較高產(chǎn)量(表達(dá)量為0.23mg/mL)，不僅成本低廉，而且生產(chǎn)工藝簡單，適合規(guī)模化生產(chǎn)，有利于工業(yè)規(guī)模的分離和下游加工?？咕囼?yàn)發(fā)現(xiàn)表達(dá)后的抗菌重組多肽Lfa-AA-Lfc對(duì)細(xì)菌6個(gè)屬中的大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、壞死梭桿菌、停乳鏈球菌、雞白痢沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌等菌株均有抗菌活性，初步說明該表達(dá)后的抗菌重組多肽Lfa-AA-Lfc的抗菌廣譜。經(jīng)肌肉注射途徑對(duì)綿羊給藥，通過血漿抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)注射后20分鐘至試驗(yàn)結(jié)束的7個(gè)小時(shí)內(nèi)，血漿對(duì)停乳鏈球菌有較強(qiáng)的抗菌效果，表明肌肉注射給藥吸收效果良好，被機(jī)體吸收后的抗菌活性穩(wěn)定。本專利技術(shù)中所設(shè)計(jì)的基因也可以克隆到原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)生產(chǎn)；也可利用蛋白質(zhì)合成方法制備本專利技術(shù)中所設(shè)計(jì)的多肽。附圖說明圖1 為乳鐵蛋白(lactoferrin, LF)的結(jié)構(gòu)不意圖及 Lactoferampin (Lfcin)和Lactoferampin (Lfampin)位置分布不意圖；圖 2 中圖 2A 為 Lactoferampin (Lfcin)和 Lactoferampin (Lfampin)在乳鐵蛋白(lactoferrin,LF)中的位置分布不意圖，圖 2B 為 Lactoferampin(Lfcin)和 Lactoferampin(Lfampin)的一種嵌合結(jié)構(gòu)肽鏈(N-FKCRRWQWRMKKLG-本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種抗菌重組多肽，其特征在于，該抗菌重組多肽的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ?ID?NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ?ID?NO:2所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種抗菌重組多肽，其特征在于，該抗菌重組多肽的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:2所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗菌重組多肽，其特征在于，所述抗菌重組多肽的表達(dá)量為 0.23mg/ml 2.3mg/ml。3.如權(quán)利要求1所述的一種抗菌重組多肽的基因表達(dá)載體，其特征在于，該基因表達(dá)載體通過以下方法得到:合成抗菌重組多肽Lfa-AA-Lfc基因，將該基因與pGEM-T EasyVector連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌C600感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆測序，將...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：苗青青，
申請(專利權(quán))人：苗青青，
類型：發(fā)明
國別省市：