鹽藻肌醇磷酸合酶基因、其編碼蛋白及其應用制造技術

本發明專利技術涉及一種鹽藻（Dunaliellaviridis）肌醇磷酸合酶（myo-Inositol-1-phosphatesynthase,MIPS）基因DvMIPS、其編碼蛋白及其應用。該基因為SEQIDNO1所示的DNA序列。本發明專利技術首次從鹽藻（Dunaliellaviridis）中分離到肌醇磷酸合酶（myo-Inositol-1-phosphatesynthase，MIPS）基因DvMIPS，并通過轉化酵母細胞證明該基因不但具有肌醇磷酸合酶功能，還具有提高生物耐鹽性狀的應用價值。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種具有耐鹽功能的基因、其編碼蛋白及其應用。特別涉及一種鹽藻^Dunaliella Firit/is)肌醇憐酸合酶(myo-1nositol-l-phosphate synthase, MIPS)基因DvMIPS,其編碼蛋白及其應用。
技術介紹
世界人口日益增長，耕地面積日趨減少，提高農作物產量成為了解決這對矛盾的重要途徑。然而土壤鹽潰化、干旱、營養貧瘠和極端溫度等各種環境脅迫嚴重影響了農作物的生長和發育，并降低其產量。世界可耕土地中有20%出現嚴重的鹽潰化，嚴重影響了農作物的產量。研究生物的抗鹽機制，利用分子生物學技術來獲得抗性基因，揭示生物與逆境之間的關系，輔助作物育種，已經成為了提高農作物產量的有效途徑之一。植物在長期的進化過程當中，針對鹽脅迫產生了一整套的應答機制。如激活植物脅迫應答的細胞信號通路，引起細胞應答如積累大量的滲透保護物質、維持細胞內離子動態平衡、修復被破壞的蛋白和膜系統、清除活性氧自由基等。目前人們已經通過對擬南芥等模式植物的研究，在植物耐鹽方面取得了巨大的研究成果。但是以非鹽生植物作為研究的模式植物，不可能完全揭示植物的耐鹽機制。鹽生模式植物正受到世界范圍內學者們的關注。其中杜氏藻屬是自然界中廣泛存在的真核單細胞綠藻。它廣泛分布于鹽湖、海洋、鹽土等高鹽度的環境中，是高鹽水域中的主要的生物種群，很容易從自然環境中分離得到。^MQDunaliella ririt/is)是杜氏藻屬中具有代表性的一個種。該種又稱杜氏鹽藻、綠色杜氏藻、鹽生綠色杜氏藻等。鹽藻對環境具有極強的適應能力，可在從0.05mol/L到飽和NaCl (約5.5 mol/L)的條件下生長,是已知最耐鹽的真核生物之一。鹽藻極強的耐鹽能力、簡單的細胞結構以及便利的培養條件使鹽藻成為研究植物適應高鹽脅迫的分子機制的重要模式生物。鹽藻很容易從自然環境中分離得到，也可以向藻種保存中心索取。因此，鹽藻成為了一個重要的耐逆基因資源寶庫。肌醇憐酸合酶(myo-1nositol-l-phosphatesynthase, MIPS)是一種在真核和原核生物界高度保守的酶。在大多數真核生物和個別原核生物系統中，MIPS的催化反應需要NAD+輔因子。NAD+輔因子的結合基序在MIPS氨基酸序列的功能域中是保守的。MIPS可以催化六憐酸葡萄糖(glucose 6-phosphate)向肌醇憐酸(L-myo-1nositol 1-phosphate)的轉化。肌醇及其衍生物參與多種生物化學及生理學過程，包括:細胞內信號轉導、膜建成和轉運、膜相關蛋白定位以及細胞壁的形成等。植物細胞中的肌醇分子還參與了更多的生命過程，包括形成植酸等儲存物質、調節植物細胞抗逆、促進種子脫水、修飾生長素、參與細胞壁組成等。在植物組織中已報導的MIPS有兩種:細胞質類型和葉綠體類型。葉綠體類型與類囊體膜相關，受光條件的調控，而細胞質類型參與各種重要代謝反應。在生物學和免疫學的特性上，葉綠體類型與細胞質類型的MIPS是相似的。它們在脅迫反應中起著重要作用，如耐鹽，耐干旱，參與細胞程序化死亡的過程等。在肌醇和肌醇衍生物的合成過程中，MIPS基因的合成受光和鹽的調控。目前還沒有文獻報道鹽藻中MIPS蛋白的功能?？寺》治鳆}藻中基因有助于深入理解鹽藻抗鹽機制，同時也為生物耐鹽基因工程和分子育種提供了新的基因資源。
技術實現思路
本專利技術的目的之一在于提供一種鹽藻肌醇磷酸合酶(myo-1nositol-1-phosphatesynthase,MIPS)基因。該基因是從鹽藻iMmmliella virit/is)中分離出來的,爾、％DvMIPS。本專利技術的目的之二在于提供該基因的編碼蛋白。本專利技術的目的之三在于提供該基因在催化六磷酸葡萄糖(glucose 6-phosphate)向肌醇磷酸(L-myo-1nositol 1-phosphate)轉化中的應用。本專利技術的目的之四在于提供了該基因在提高生物耐鹽性狀中的應用。為達以上目的，本專利技術通過下述方案實現: O 一種鹽藻肌醇磷酸合酶基因，其特征在于該基因為SEQ ID NO I所示的堿基序列； 2)—種上述的基因的編碼蛋白，該蛋白為SEQ ID NO 2所不的氣基酸序列； 3)上述的基因，具有可以 催化六磷酸葡萄糖(glucose 6-phosphate)向肌醇磷酸(L-myo-1nositol 1-phosphate)轉化的肌醇磷酸合酶的應用功能。4)上述的基因在提高生物耐鹽性狀中的應用。本專利技術通過鹽脅迫處理，采用酵母功能互補系統，首次從鹽藻中克隆到了一個肌醇磷酸合酶基因，并通過實驗證明了該基因還具有提高生物耐鹽性狀的應用價值。附圖說明圖1為本專利技術基因編碼的肌醇磷酸合酶蛋白進化樹分析圖。圖2為本專利技術融合His標簽的伽#//5基因編碼蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。M:蛋白 marker ;1:pET32a 未誘導的全菌；2:pET32a 全菌；3:pET32a 上清；4:pET32a 沉淀；5:pET32a_DvMIPS 未誘導的全菌；6:pET32a_DvMIPS 全菌；7:pET32a_DvMIPS上清；8:PET32a-DvMIPS沉淀；箭頭所示為誘導表達融合His標簽的辦#//5基因編碼蛋白。圖3為本專利技術基因編碼蛋白的肌醇磷酸合酶活性測定圖。**表示融合His標簽的基因編碼蛋白與空載蛋白相比，兩者的肌醇磷酸合酶活性具有極顯著的差異(Ρ〈0.01)。圖4為本專利技術基因在酵母突變體G19中的耐鹽功能分析。即 .含DvMIPS完整ORF的EST序列(Contig 187)插入到酵母表達載體pAJ401中，轉化酵母鹽敏感突變體G19，在含不同濃度NaCl的 表型展示培養基上進行耐鹽表型測定。具體實施方法 下面結合具體實施例，進一步闡述本專利技術。應理解，這些實例僅用于說明本專利技術而不用于限制本專利技術的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件，分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)或酵母遺傳學方法(Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual,Adams A et.al.編，Cold Spring Harbor Laboratory, 1998 出版)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例一全長編碼區的克隆與分析 對鹽藻(ft ririi/is)受不同濃度鹽誘導的cDNA文庫EST序列(表達序列標簽)進行分析，重點分析表達量明顯受鹽誘導的序列。通過序列比對，從編號contig 187的EST序列中分離到了一個鹽藻肌醇磷酸合酶基因，命名為DvMIPS。DvMIPS的開放閱讀框(ORF)為1548 bp，cDNA全長2194 bp，含有綠藻基因特異的加尾信號TGTAA及poly (A)結構。實施例二編碼的蛋白結構、同源分析 Vector NTI軟件的分析結果顯示:該基因編碼一個含516個氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小為56.9 kDa，等電點為5.38。與其他物種的MIPS基因具有較高的同源性，該基因編碼的蛋白還具有 inos-本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種鹽藻肌醇磷酸合酶基因，其特征在于該基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO?1?所示的堿基序列。

【技術特征摘要】
1.一種鹽藻肌醇磷酸合酶基因，其特征在于該基因的核苷酸序列為SEQ ID NO I所示的堿基序列。2.一種根據權利要求1所述的基因編碼的蛋白，其特征在于該蛋白具的氨基酸序列為SE...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李平，孫文杰，李松，俞頔，王超，宋任濤，許政暟，
申請(專利權)人：上海大學，
類型：發明
國別省市：