一種利用喜樹AOC基因轉化提高煙草抗凍性能的方法技術

本發明專利技術屬于分子生物學以及基因工程技術領域，具體為一種利用喜樹AOC基因轉化提高煙草抗凍性能的方法。本發明專利技術包含利用喜樹丙二烯氧化物環化酶（AOC）基因構建植物表達載體，利用基因工程技術在煙草中過量表達喜樹AOC基因，增強煙草抗凍性能。其過程是從喜樹中克隆AOC基因，構建了植物高效表達載體，導入農桿菌并遺傳轉化煙草，測定轉基因煙草葉片低溫處理后的電導率。本方法可以在煙草中過量表達喜樹AOC基因，提高煙草的抗凍性能。

【技術實現步驟摘要】
—種利用喜樹AOC基因轉化提高煙草抗凍性能的方法
本專利技術屬于分子生物學以及基因工程
，具體涉及一種利用基因工程技術提高煙草抗凍性能的方法。
技術介紹
茉莉酸類物質是植物界中普遍存在的一種激素，參與植物發育和逆境脅迫下應激反應的信號傳導過程。內源和外源的茉莉酸類化合物能顯著提高植物對機械損傷、動物撕咬、病蟲害侵染、低溫、高鹽等不利外界環境的耐受能力。在植物中，茉莉酸類物質的合成途徑是從細胞膜上釋放的亞麻酸開始，在脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶、丙二烯氧化物環化酶、OPDA (12-0X0-(10, 15Z)-phytodienoic acid)還原酶、β _氧化酶、茉莉酸甲基化酶等一系列酶的催化生成茉莉酸和甲基茉莉酸。其中由于丙二烯氧化物會自發水解，由此丙二烯氧化物環化酶的作用在茉莉酸類物質的合成途徑中尤為重要。作為一種重要的模式植物，且易于進行遺傳轉化，煙草是植物的信號途徑研究中的熱門對象；作為一種廣泛種植的經濟作物，煙草的抗逆性能在物種品質和經濟價值上具有非常重要的意義。煙草的抗凍研究目前涉及葡萄糖醛酸苷酶(GUS)蛋白，超氧物岐化酶(SOD)蛋白等。相比較而言，利用來源于喜樹的茉莉酸類物質合成途徑的關鍵酶丙二烯氧化物環化酶的基因工程來系統性地提高煙草的抗凍性能具有很大的優勢(I)在茉莉酸類物質的合成和信號傳導研究領域，全世界的研究人員已經進行了幾十年的深入研究，其生理作用和生化機制比較清楚，為在基因工程中利用茉莉酸類物質生物合成途徑的基因打下了良好的理論和實踐基礎。(2)提供一種全新的思路，采用轉aoc基因提高煙草抗凍性能的方法。 喜樹是一種和煙草親緣關系比較遠的植物，來源于喜樹的丙二烯氧化物環化酶在煙草中能順利表達并達到高活性效果，提高了尼古丁含量。這為開展植物基因工程研究提供了一個新的方向。 目前，尚未有任何與本專利申請中所提及的應用基因工程技術把喜樹的茉莉酸物質生物合成途徑的酶基因尤其是丙二烯氧化物環化酶轉到煙草中，提高煙草抗凍性能的相關報道，包括專利和文獻。
技術實現思路
本專利技術的第一目的就是提供一種利用基因工程技術提高煙草抗凍性能的方法，該方法將來源于喜樹的丙二烯氧化物環化酶基因轉到煙草中。本專利技術的第二目的是提供一種高效表達載體，它包含上述喜樹的丙二烯氧化物環化酶基因片斷。本專利技術的第三目的是提供一種用上述高效表達載體轉化的宿主細胞。在實例中該宿主細胞是煙草。本方法的技術方案如下本專利技術分離出的DNA分子，具有編碼丙二烯氧化物環化酶的核苷酸序列的核心片斷， 該核心片斷來源于由申請人在GenBank中登錄的喜樹iCamptotheca丙二烯氧化物環化酶基因(登錄號AY863428)的核苷酸序列,用引物Pl (5’-gg actaRt Atg get get tea tea act tc_3’，酶切位點用下劃線表示)和 P2 (5’-ga ggttacc Tea gtc agt gaa gtt agg aa_3’，feiEII酶切位點用下劃線表示),采用PCR法可以從喜樹cDNA文庫中擴增出該核心片斷，喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的cDNA序列見SEQ ID N0:1，其全長 1129bp，開放閱讀框位置為第72位堿基到第812位堿基。本專利技術提出的利用轉基因技術提高煙草抗凍能力的方法，是利用具有編碼喜樹丙二烯氧化物環化酶(AOC)的核苷酸序列(Genbank No. :AY863428)的植物表達載體,采用轉基因方法在煙草細胞、組織、器官、植株中過量表達喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的DNA分子。其具體步驟如下(1)采用任何可能的手段(如基因克隆、人工合成基因等方法)獲得喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的核心片斷；(2)把喜樹丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷可操作地連于表達調控序列，形成表達載體；(3)采用任何轉基因方法轉移喜樹丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷到煙草細胞、組織、器官、植株中；(4)在特定的條件下篩選和鑒定轉化子；(5)在適合的條件下培養抗凍性能提高的煙草轉化子，獲得轉基因后代。本專利技術涉及的載體包含具有編碼喜樹丙二烯氧化物環化酶的核苷酸序列的核心片斷的DNA。用上述方法獲得的生命體，它是抗凍性能提高了的煙草的細胞、組織、器官、植株。在本專利技術中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒等。在本專利技術中，術語“生命體”指煙草的細胞、組織、器官，或植株。在本專利技術中，術語“任何可能的手段”為獲得喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的方法，具體包括同源性克隆(如RT-PCR、RACE等)、文庫篩選而后人工合成喜樹丙二烯氧化物環化酶基因及其變異體。在本專利技術中，術語“任何轉基因方法”包括根癌農桿菌Ti質粒介導基因轉化、發根農桿菌Ri質粒介導基因轉化、植物病毒載體介導基因轉化、PEG介導基因轉化、脂質體介導基因轉化、電擊法介導基因轉化、超聲波介導基因轉化、顯微注射介導基因轉化、激光微束介導基因轉化、基因槍介導基因轉化、花粉管通道介導基因轉化、生殖細胞浸泡法介導基因轉化。在本專利技術中，術語“在特定的條件下篩選和鑒定轉化子”是指在離體培養的條件下用抗生素(卡那霉素、潮霉素、G418等)選擇出有抗生素抗性的轉化子；可以使用PCR、 Southern雜交、Northern雜交和Western印跡等方法來鑒定轉化子。在本專利技術中，術語“在適合的條件下培養抗凍性能提 高的煙草轉化子，獲得轉基因后代”是指對經過鑒定的轉化子離體培養，并檢測抗凍性能，篩選抗凍性能提高的優良轉化子進行培養，獲得轉基因后代。本專利技術從喜樹中克隆丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷，并構建了植物高效表達載體，導入農桿菌并遺傳轉化煙草，以提高煙草的抗凍性能，提高了煙草的種質，增強了栽培適宜性。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本專利技術。應理解，這些實施僅用于說明本專利技術而不用于限制本專利技術的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件， 例如《分子克隆》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照廠商所建議的條件。實施例1 喜樹丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷的合成，及表達載體和工程菌的構建。1、喜樹丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷的獲得根據喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的全長序列，在該基因的內部第72堿基至第812堿基之間設計引物，擴增741bp序列作為基因片斷，并根據植物表達載體PCAMBIA1304的多克隆酶切位點，分別設計兩條含有5^1和^siEII限制性內切酶位點以及保護堿基的PCR擴增引物，其引物序列為Pl 5' -ggactagtAtggctgcttcatcaacttc-3' (SEQ ID NO:2) ,酶切位點用下劃線表示P2 5' -gaggttaccTcagtcagtgaagttaggaa-3' (SEQ ID NO 3) , ifeiEII 酶切位點用下劃線表示從喜樹的葉片抽提總RNA (上海華舜生物工程有限公司植物RNA提取試劑盒)，反轉錄成cDNA(TaKaRa RNA PCR Kit)，然后進行PCR擴增，PCR反應體系為50 μ L，包含去離子水， 10XPCR 緩沖液 5yL，dNTP I μ LjMgCl2 3 μ L，引物各 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種分離出的DNA分子，具有編碼丙二烯氧化物環化酶的核苷酸序列的核心片斷，該核心片斷來源于丙二烯氧化物環化酶基因的核苷酸序列，用引物SEQ?ID?NO:2?和SEQ?ID?NO:3，采用PCR法從喜樹cDNA文庫中擴增獲得，喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的cDNA序列見SEQ?ID?NO：1，其全長1129bp，開放閱讀框位置為第72位堿基到第812位堿基。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：皮妍，崔勇，蔣科技，孫小芬，
申請(專利權)人：復旦大學，
類型：發明
國別省市：