本發(fā)明專利技術(shù)公開了抗大豆脂肪氧化酶Lox3的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，保藏編號(hào)為：CGMCC5123，本發(fā)明專利技術(shù)還公開了由該雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的單克隆抗體及其在檢測(cè)大豆脂肪氧化酶Lox3中的應(yīng)用。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其單克隆抗體，特別涉及分別分泌抗大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2和Lox3的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其單克隆抗體,細(xì) 胞株保藏編號(hào)分別為CGMCC5121、CGMCC5122及CGMCC5123，還涉及各自分泌的單克隆抗體在利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(DAS-ELISA)檢測(cè)大豆脂肪氧化酶同功酶當(dāng)中的應(yīng)用，屬于生物檢測(cè)
技術(shù)介紹
大豆中含有三種脂肪氧化酶(Lipoxygenase,簡(jiǎn)稱Lox)同功酶即Loxl、Lox2和Lox3,它們能專一催化具有cis, cis-1, 4-戍二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸通過分子加氧，形成具有共軛雙鍵的氫過氧化衍生物，即醛、酮等具有揮發(fā)性的異味物質(zhì)，使大豆具有豆腥味，從而降低了豆制品的耐儲(chǔ)性、食用性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。通常在大豆加工過程中人們通過加熱、微波照射、改變介質(zhì)的PH值、有機(jī)溶劑萃取和醛水解酶等方法消除豆腥味，但這些方法都會(huì)不同程度地降低豆制品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并且使得成本增高。培育脂肪氧化酶缺失品種可以從根本上解決上述問題。但在脂肪氧化酶缺失材料的選育過程中，Lox在田間不存在指示性狀，從種子外觀和農(nóng)藝性狀上無法鑒別，并且田間脂肪氧化酶缺失材料選擇工作量大，因此急需一種快速、簡(jiǎn)便、成本低、一次可以同時(shí)檢測(cè)出三種脂肪氧化酶的檢測(cè)方法。目前脂肪氧化酶的常用的檢測(cè)方法是薄層等電聚焦電泳(IEF)檢測(cè)方法，這種方法主要是通過酶染法和蛋白染色方法結(jié)合使Lox同功酶帶顯色，雖然能同時(shí)檢測(cè)出三種脂肪氧化酶，但檢測(cè)中常常會(huì)因Lox的缺失而發(fā)生其它Lox等電點(diǎn)正極漂移現(xiàn)象；另外該方法所需設(shè)備、試劑昂貴，操作要求嚴(yán)格，一般育種、倉儲(chǔ)單位和加工質(zhì)檢部門不便操作。另外據(jù)日本Suzuki, Y 等 1992 年報(bào)道(Prodution and use ofmonolional antibodies against rice embryo lipoxygenase-3, Biosci Biotech.Biochem. 56:678-679):用單克隆抗體可以檢測(cè)水稻中的Lox3,這種方法雖然結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但檢測(cè)過程中除需要做封閉外，還需要過夜包被酶標(biāo)板，因此耗時(shí)，操作起來不方便。申請(qǐng)?zhí)?0112539. 7的專利公開了一種作物脂肪氧化酶同功酶的檢測(cè)方法，該方法具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀等特點(diǎn)。但由于它是利用脂肪氧化酶的偶聯(lián)氧化還原指示劑顯色反應(yīng)的原理來進(jìn)行測(cè)定的，所以它的靈敏度和特異性受到一定的限制。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于避免上述方法的缺陷，建立能分別分泌抗大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2、Lox3的特異性單克隆抗體的3個(gè)雜交瘤細(xì)胞株,利用這些細(xì)胞株分泌的特異性單克隆抗體來組裝可以用于同時(shí)檢測(cè)大豆中三種脂肪氧化酶同功酶的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(DAS-ELISA)檢測(cè)試劑盒 。該試劑盒適用于對(duì)大豆中三種脂肪氧化酶的定性和定量測(cè)定。本專利技術(shù)所解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供了一組抗大豆脂肪氧化酶同功酶的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于所述的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株包括抗大豆脂肪氧化酶Loxl的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，為小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞融合產(chǎn)生，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為CGMCC5121 ;及抗大豆脂肪氧化酶Lox2的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，為小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞融合產(chǎn)生，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為CGMCC5122 ;及抗大豆脂肪氧化酶Lox3的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，為小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞融合產(chǎn)生，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為CGMCC5123。所述的抗大豆脂肪氧化酶Loxl、Lox2、Lox3的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立方法如下①免疫抗原制備分別取單缺Loxl的大豆種子(記為L(zhǎng)ox-1)、單缺Lox2的大豆種子五星2號(hào)(記為L(zhǎng)ox-2)、單缺Lox3的大豆種子(記為L(zhǎng)ox_3) (Lox_l、Lox_3可以通過國家種質(zhì)庫獲得，五星2號(hào)(Lox-2)可以從市場(chǎng)上買到)，用鋼銼磨成豆粉，以及Sigma公司產(chǎn)品Soybean Lox typel_B (同時(shí)含有3種大豆脂肪氧化酶,幾乎不含其它大豆蛋白),分別與8 15倍體積的的pH為8. 0的Tris — CaCl2緩沖液混勻，浸提0. 5-1小時(shí)，4°C 12000rpm離心IOmin,,取上清備用，分別為L(zhǎng)ox-1上清液、Lox_2上清液、Lox_3上清液、Soybean Loxtype1-B上清液；②小鼠免疫選擇4 6周齡的行動(dòng)敏捷的純系BALB/C雌小鼠，分別稱量各小鼠體重并標(biāo)記；取步驟①中制備的Lox-1、Lox-2、Lox-3上清液，用生理鹽水將其稀釋到蛋白含量4mg/ml，加入等體積弗氏完全佐劑混合后，采取皮下多點(diǎn)注射首次免疫小鼠，各上清液分別免疫5只小鼠并做標(biāo)記,每只小鼠的免疫劑量為0. 4 0. 6mg ；③注射環(huán)磷酰胺溶液(CY):將步驟②中首次免疫的小鼠分別于免疫10min、24h、48h后，按照90mg/kg的量分別對(duì)小鼠進(jìn)行頸背部多點(diǎn)注射濃度20mg/ml的環(huán)磷酰胺溶液(CY)進(jìn)行消減；④效價(jià)測(cè)定及再次免疫首次免疫I周后用步驟①中制備的Soybean Loxtypel-B上清液作抗原對(duì)步驟③中的小鼠按照步驟②方法再次進(jìn)行免疫，第二次免疫一周后進(jìn)行第三次免疫，第三次免疫后第四天從小鼠尾部分別取血2-3滴，離心取上清，用間接酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定其效價(jià)(效價(jià)測(cè)定利用Soybean Lox typel_B包被),如果效價(jià)小于1:1600,1周后對(duì)各小鼠用Soybean Lox typel-B按照步驟②方法再次進(jìn)行免疫,并進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，直至血清效價(jià)達(dá)到或高于1:1600為止；⑤加強(qiáng)免疫3種免疫小鼠中，每種均選擇血清效價(jià)最高的小鼠在細(xì)胞融合前3天按步驟④加強(qiáng)免疫I次；⑥細(xì)胞融合分別取步驟⑤中的不同小鼠的脾細(xì)胞與復(fù)蘇的SP2/0細(xì)胞混勻，在細(xì)胞培養(yǎng)板HAT培養(yǎng)基上分別篩選陽性雜交瘤細(xì)胞；⑦特異性陽性細(xì)胞株篩選細(xì)胞融合7 15天后，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法，利用Soybean Lox typel_B作為檢測(cè)抗原進(jìn)行陽性篩選，同時(shí)利用單缺Loxl的大豆種子(Lox-1)的豆粉上清液作為檢測(cè)抗原進(jìn)行交叉檢測(cè)，上清液的0D450值與空白對(duì)照孔的0D450值之比大于2.1的即判斷為陽性孔，并且與Lox-1反應(yīng)表現(xiàn)為陰性的孔，其中的雜交瘤細(xì)胞稱為陽性細(xì)胞株，該細(xì)胞株分泌的單克隆抗體為特異性抗Loxl的。用同樣的方法，均利用Soybean Lox typel_B作為檢測(cè)抗原進(jìn)行陽性篩選,利用五星2號(hào)豆粉上清液對(duì)分泌抗Lox2的單克隆抗體進(jìn)行交叉檢測(cè),利用Lox-3豆粉上清液對(duì)分泌抗Lox3的單克隆抗體進(jìn)行交叉檢測(cè)；⑧亞克隆采用有限稀釋法對(duì)步驟⑦中篩選到的3種陽性細(xì)胞株分別進(jìn)行亞克隆，連續(xù)兩次亞克隆之后剔除掉假陽性細(xì)胞株，在檢測(cè)過程中均按照⑦中的方法同時(shí)進(jìn)行 陽性和交叉檢測(cè)，最終可以獲得分別分泌抗Loxl、Lox2、Lox3的特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。本專利技術(shù)所解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供由權(quán)利要求1所述的單克隆抗體雜交本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
抗大豆脂肪氧化酶Lox3的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于所述的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株為小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞融合產(chǎn)生，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為：CGMCC5123。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張孟臣，馬志民，秦君，閆龍，李亞璞，蔣春志，邸銳，唐曉東，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。