本發明專利技術涉及一種高特異性和親合力的抗孕酮的單克隆抗體、產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞以及其應用，特別是在檢測人體孕激素水平中的應用。本發明專利技術采用孕酮完全抗原免疫動物，達到理想效價后進行細胞融合，然后篩選異性較高的細胞單株并進行保藏，該細胞單株能夠持續分泌單克隆抗體，便于進行孕酮的檢測，從而為檢測孕酮的試劑盒研發奠定了基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種抗孕酮的單克隆抗體、產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞及其應用，特別是在檢測人體孕激素水平中的應用。
技術介紹
孕酮(Progesterone)是由卵巢黃體分泌的一種天然孕激素,在體內對雌激素激發過的子宮內膜有顯著的形態學影響，為維持妊娠所必需，臨床用于先兆性流產、習慣性流產等閉經或閉經原因的反應性診斷等。孕酮是女性分泌的一種重要的天然激素，這種激素對于女性來說的作用非常大，它能夠維持黃體激素分泌，幫助女性生育能夠順利進行，還可以配合雌激素，對于孕期的其它方面發揮作用。 血清/血漿孕酮檢測的臨床應用主要包括以下幾個方面1、血中孕酮升高可見于以下情況(a)觀察婦女排卵的時間及黃體酮的生成情況，在排卵的_1，0，+1天，孕酮含量成倍增加，提示為有排卵；(b)正常妊娠、雙胎和多胎妊娠時孕酮合成量明顯增加，血液中孕酮水平相對升高；(C)妊娠毒血癥、先兆子癇、葡萄胎及原性高血壓時,孕酮含量也會升高。2、血中孕酮含量降低見于以下情況(a)先兆流產、宮外孕、早產、閉經、不孕癥；(b)黃體功能不全，卵巢黃體發育不全時，孕酮含量相應降低；(c)腎上腺、甲狀腺功能嚴重失調也可影響卵巢功能，使排卵發生障礙，孕酮含量也會相應降低。目前，檢測孕酮的方法包括膠體金試紙條檢測法、化學發光法、放射性免疫法(RIA)和酶聯免疫吸附試驗(Elisa)，這些方法都涉及到孕酮抗原和孕酮抗體兩大核心免疫試劑。由于孕酮屬于小分子物質(分子量為314. 5Da)，只具有抗原性，而無免疫原性。因此，必需將孕酮與載體蛋白偶聯后制成完全抗原再通過免疫動物來制備抗體，這就增加了檢測的步驟和復雜程度，造成檢測靈敏度的下降。如中國專利CN101066998公開了制備甲羥孕酮醋酸酯特異性抗體的制備方法，該方法即是通過先制備半抗原，然后將得到的半抗原與蛋白質偶聯制備完全抗原，然后再免疫動物從而得到特異性抗體，但該方法存在著步驟較為繁瑣的缺陷。
技術實現思路
本專利技術即是針對目前孕酮檢測方法中存在的上述不足之處，提供一種特異性和親和力高的單克隆抗體與產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞及其應用。本專利技術的思路在于采用孕酮完全抗原免疫動物，達到理想效價后進行細胞融合，從而篩選異性較高的細胞單株，該細胞單株能夠持續分泌單克隆抗體，便于進行孕酮的檢測，從而為檢測孕酮的試劑盒研發奠定了基礎。本專利技術的目的之一是提供一種特異性分泌抗孕酮單克隆抗體的雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株于2012年11月9日保藏于中國北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC NO. 6803，分類命名為孕酮單克隆抗體雜交瘤細胞株。本專利技術的另一個目的是提供該雜交瘤細胞株的制備方法，該方法包括如下的步驟1、動物免疫采用孕酮衍生物P4-11 a -半琥珀酸酯-BSA作為免疫抗原免疫BALB/c小鼠，檢測免疫鼠血清效價，效價達到1:1OW即可做細胞融合；2、細胞融合取免疫小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞株Sp2/0，在50%PEG1450下進行融合； 3、陽性檢測用檢測抗原P-3-CM0-BSA包被酶標板，檢測到陽性細胞后進行亞克隆，經過3飛次亞克隆達到100%的陽性率；4、抗體純化在預先注射石蠟油致敏的BALB/c小鼠腹腔接種已建株的雜交瘤細胞，采集腹水并離心得上清后用SDS-PAGE電泳鑒定純度；5、抗體的鑒定與雜交瘤細胞株的篩選和保藏將穩定分泌抗孕酮單克隆抗體的雜交瘤細胞株制備腹水，純化抗體，得到純化抗體后檢測抗體效價，篩選出表達高親和性抗體的雜交瘤細胞株，并對該細胞株進行保藏。進一步的，本專利技術所述的雜交瘤細胞株的制備方法，包括如下的步驟1、動物免疫P4-11 a -半琥珀酸酯-BSA作為免疫抗原免疫BALB/c小鼠，首次免疫，50 U g/只的抗原加等體積完全福氏佐劑，采用皮下注射；4周后，第二次免疫，用25 y g/只的抗原加等體積不完全福氏佐劑，皮下注射；2周后，第三次免疫，用25 y g/只的抗原加等體積不完全福氏佐劑，皮下注射，7-10天后，ELISA法檢測免疫鼠血清效價，效價達到1:1Off即可準備做細胞融合；2、細胞融合取免疫小鼠脾臟細胞(I X IO8個細胞)與骨髓瘤細胞株Sp2/0 (1父107個細胞％)，在50%PEG1450作用下進行常規融合，融合細胞用HAT培養基作選擇性培養，7d后改用HT培養基，14d后改用DMEM培養基培養(20%小牛血清)；3、陽性檢測用包被濃度為200ng/ml的檢測抗原P-3_CM0_BSA包被酶標板，96孔細胞培養板的每個待檢孔取IOOul加入包被好的酶標板，檢測到陽性細胞再進行亞克隆，經過3飛次亞克隆直到達到100%的陽性率；4、抗體純化在預先I周注射0. 5ml/只石蠟油的致敏BALB/c小鼠腹腔接種已建株的雜交瘤細胞數為106，7 IOd后采集腹水并離心得上清，腹水上清按1:10稀釋于PBS中，并以0. 5ml/min上樣于經PBS平衡的HiTrap Protein G親和層析柱中，用PBS洗雜，再用pH2. 9甘氨酸緩沖液洗脫后用SDS-PAGE電泳鑒定純度；5、抗體的鑒定與雜交瘤細胞株的篩選和保藏得到純化抗體后，將穩定分泌抗孕酮單克隆抗體的雜交瘤細胞株制備腹水，純化抗體，得到純化抗體后，用ELISA法檢測抗體效價，然后再用競爭ELISA法檢測各抗體的效價，從中篩選出表達高親和性抗體的雜交瘤細胞株，并對該細胞株進行保藏。更進一步的，在上述方法步驟5中，競爭ELISA法包括下述的步驟I)用濃度為0. 01mol/L、pH9. 6的碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋至200ng/ml后包被酶標板，4 °C過夜； 2)用 PBS/T20 洗板 3 次，每次 3min ；3)用含5%小牛血清的PBS/T20封閉，37°C孵育lh，洗板；4)每孔加入0、1、4、10、20和40ng/ml孕酮的人血清50ul后，再加入濃度為50ii g/ml的純化抗體50ul，37°C孵育45min，洗板3次；5)加入稀釋比例為1:2000的HRP-羊抗鼠100ul，37°C孵育30min，洗板3次；6)加入TMB顯色液，37°C避光反應15min后，加人終止液，讀取波長為450nm時的OD值。本專利技術的再一個目的是提供由上述保藏號為CGMCC NO. 6803的雜交瘤細胞株所分泌的單克隆抗體，該抗體具有高度的特異性和親和性，能夠與孕酮結合，從而進行檢測。本專利技術的再一個目的是提供由上述雜交瘤細胞所分泌的單克隆抗體在檢測人體孕酮水平中的應用，包括但不限于將該單克隆抗體用于制備檢測人體孕酮水平的試劑盒。本專利技術得到的抗體能夠特異性且高親合性地與孕酮結合，因此可以用在檢測孕酮水平的試劑盒中。本專利技術所述的抗孕酮的單克隆抗體具有特異性和親合力高的優點，經保藏后的雜交瘤細胞能夠穩定地分泌此種單抗，便于進行檢測試劑盒的制備，為臨床大規模試劑盒的生產奠定了基礎。附圖說明圖1是保藏號為CGMCC NO. 6803的雜交瘤細胞株所分泌的抗體的競爭性ELISA法檢測的抗體濃度和OD值的關系曲線。具體實施例方式以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。在不違反本專利技術精神實質的范圍內，本領域的一本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種分泌抗孕酮的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞的保藏號為CGMCC?NO.6803。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：不公告發明人，
申請(專利權)人：北京利德曼生化股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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