本發明專利技術公開了嘔吐毒素雜交瘤、單克隆抗體及其制備方法及用途。以嘔吐毒素與牛血清白蛋白偶聯物為免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，將小鼠的脾臟細胞與骨髓瘤細胞SP2/0制備雜交瘤細胞，經間接ELISA篩選和有限稀釋法獲得單克隆抗體雜交瘤細胞株D-2-1CGMCC?No.5161，將雜交瘤細胞株注射于小鼠腹腔內生產單克隆抗體，將該抗體應用于嘔吐霉素間接競爭ELISA測定。本發明專利技術單克隆抗體可特異性檢測嘔吐毒素，靈敏度高，以此單克隆抗體制備的ELISA試劑盒檢測嘔吐毒素，成本低，無需大型儀器設備，操作簡便，便于推廣利用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種雜交瘤、單克隆抗體及其制備與用途，具體涉及嘔吐毒素雜交瘤、嘔吐毒素單克隆抗體及其制備方法與用途。
技術介紹
嘔吐毒素(化學結構式見圖I)，化學上稱作脫氧腐鐮刀菌烯醇，屬于霉菌的單端孢菌素族，具有很高的細胞毒性及免疫抑制性質，禾谷鐮刀菌、擬枝鐮刀菌，梨孢鐮刀菌等鐮刀菌株及頭孢均屬、漆班菌屬、木霉菌等菌株都可產生該毒素，嘔吐毒素對糧谷類的污染非常普遍。嘔吐毒素可引起雛鴨、豬、貓、狗等動物嚴重的嘔吐反應，嚴重者可造成死亡。急性中毒的動物主要表現為站立不穩、反應遲鈍、豎毛、食欲下降、嘔吐等，還可引起動物的拒食反應，其中豬對嘔吐毒素最為敏感，嘔吐毒素能引起豬食欲減退或廢絕、嘔吐、體重下降，流產、死胎和弱仔，抑制免疫機能和降低機體抵抗力。·目前，嘔吐毒素的檢測方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法等，儀器設備昂貴，技術水平要求較高，樣品還需要進行純化處理，不利于現場篩查。薄層色譜，樣品前處理繁瑣，實驗過程復雜，所需時間長，準確性差，對實驗人員危害較大，亦不利于現場篩查。酶聯免疫分析技術，現在已經廣泛應用于快速、微量檢測藥物殘留，酶聯免疫分析技術可定性定量檢測微量殘留有害物質，且對儀器要求低，成本低，操作快速簡便，對樣本前處理過程簡單，對檢測人員專業要求低，靈敏度較高，可適用于現場大量樣本快速檢測，實現酶聯免疫檢測技術的關鍵是合成抗體。
技術實現思路
本專利技術提供針對現有技術的上述不足，提供了一種嘔吐毒素雜交瘤、單克隆抗體及其制備方法與用途。一種嘔吐毒素雜交瘤細胞株D-2-1CGMCC No. 5161。一種嘔吐毒素單克隆抗體是由雜交瘤細胞D-2-1CGMCC No. 5161分泌的。一種嘔吐毒素單克隆抗體的制備方法，其特征在于以嘔吐毒素半抗原與牛血清白蛋白偶聯物為免疫抗原，免疫Balb/C小鼠，將小鼠的脾臟細胞與骨髓瘤細胞SP2/0制備雜交瘤細胞，經間接ELISA篩選和有限稀釋法獲得單克隆抗體雜交瘤細胞株，將雜交瘤細胞株注射于小鼠腹腔生產單克隆抗體。免疫抗原是由嘔吐毒素與馬來酸酐縮合反應，再與牛血清白蛋白偶聯得到的。本專利技術的提供一種基于上述方法制備的抗原及其單克隆抗體用于檢測嘔吐毒素及其含量的ELISA測定方法。本專利技術所述的一種檢測嘔吐毒素及其含量的ELISA測定方法，樣本中的嘔吐毒素可以與包被抗原對抗體發生競爭反應，根據其吸光度的數值可以從標準曲線上推算出樣品中嘔吐毒素的含量，該方法的靈敏度可達到O. 5μ g/L。有益效果本專利技術提供的單克隆抗體可特異性檢測嘔吐毒素，靈敏度較高，本專利技術單克隆抗體制備的ELISA試劑盒可以對食品中嘔吐毒素進行快速檢測，具有特異性高，靈敏度高，無需大型儀器設備，操作簡便，便于推廣應用的優點。附圖說明圖I嘔吐毒素結構式。圖2嘔吐毒素半抗原合成路線圖。圖3嘔吐毒素標準品競爭ELISA曲線。具體實施方式 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。實施例I嘔吐毒素完全抗原合成(I)嘔吐毒素半抗原合成(合成技術路線見圖2)20-100mg嘔吐毒素(購自上海安普科學儀器有限公司，貨號CDFV-ALX-630-115-M001)，與l_3mol馬來酸酐，催化量的DMAP，在2_5ml甲苯中，于室溫80°C攪拌反應，8-20h后，蒸干溶劑，酸化，萃取，重結晶后得到嘔吐毒素半抗原。(2)嘔吐毒素免疫抗原合成將嘔吐毒素半抗原與牛血清白蛋白偶聯得到免疫原。取60mg牛血清白蛋白溶于9.5ml PBS (O. 01mol/L，ρΗ5· O)溶液中，加入12. 5mgEDCjflA ImlDMF溶解的IOmg嘔吐毒素半抗原，室溫攪拌Ih,再加6mg EDC,暗處攪拌反應并過夜，用O. Olmol/LPBS透析3天，每天換3次透析液，得到嘔吐毒素與牛血清白蛋白的免疫抗原。(3)嘔吐毒素包被抗原合成將嘔吐毒素半抗原與卵清蛋白偶聯得到免疫原。取45mg 卵清蛋白溶于 5. 5ml PBS (O. 01mol/L，pH5. O)溶液中，加入 12. 5mgEDC，力口入ImlDMF溶解的IOmg嘔吐毒素半抗原,室溫攪拌Ih,再加6mg EDC,暗處攪拌反應并過夜，用O. Olmol/LPBS透析3天，每天換3次透析液，得到嘔吐毒素與牛血清白蛋白的免疫抗原。實施例2嘔吐毒素單克隆抗體的制備將上述所得免疫抗原與弗氏佐劑(購自Sigma公司，貨號F5881)按I : 3的比例混合，對8-10周齡Balb/c小鼠進行免疫，頸背部皮下多點注射，免疫劑量為150 μ g/只，兩周后二免，采用弗氏不完全佐劑(購自Sigma公司，貨號F5506)，免疫劑量同上；28天后三免，采用弗氏不完全佐劑，免疫劑量同上，31天后加強免，直接采用免疫原免疫。加強免疫后3天，取免疫Balb/c小鼠一只，眼眶采血后脫臼處死，在75%酒精中消毒后取脾臟，制備脾細胞懸液，轉移到50ml離心管中，加RPMI1640至30ml，1500 2000rpm離心5min,棄上清,加RPMI1640至30ml,計數待用。取3瓶生長狀態良好的(活細胞數>95%)骨髓瘤細胞，將之完全吹下，轉移到50ml離心管中，加RPMI1640至30ml, 1500 2000rpm離心5min分鐘，棄上清，加RPMI1640至30ml，計數待用。將脾細胞與骨髓瘤按照8 : I的比例混合，1500 2000rpm離心5min,將混合好的細胞離心，將沉淀細胞置于37°C水浴，加入Iml聚乙二醇(PEG) 4000，攪拌2min，隨后加入20ml無血清的PEG營養液，IOOOrpm離心lOmin，棄上清，用20 50ml完全培養液重懸細胞，鋪種于含飼養細胞96孔細胞培養板，置培養箱中。上清檢測待細胞長至孔底的1/2 1/3時，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔，將陽性細胞采用有限稀釋法進行亞克隆，10 14天后，再取細胞上清檢測，最終得到嘔吐毒素的單克隆雜交瘤細胞株，此細胞株命名為D-2-1,分類命名為嘔吐毒素單克隆抗體雜交瘤細胞株，該細胞株已于2011年08月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No. 5161。單克隆抗體的腹水制備和純化液體石蠟致敏Balb/c小鼠，6 8周，注射體積500μ I/只。10天后可制備腹水，取100到150萬細胞注射于老鼠腹腔，一周后采集腹水。采集到的腹水，用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，純化后的腹水放入-20°C環境保存。 實施例3間接ELISA法建立(I)抗原抗體效價測定取嘔吐毒素-卵清蛋白包被抗原以PBS(pH7. 4，0. Olmol/L)作I 1000，I 2000，I 3000,1 4000,1 5000稀釋，按照每孔100 μ I進行包被，37°C溫育2h，傾去包被液，用PBST洗滌2次，每孔中加入200 μ I封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內液體，備用。向板孔中加入嘔吐毒素標準品溶液50 μ I/孔，隨即加入以PBS(pH7. 4,0. Olmol/L)1 4000稀釋的羊抗鼠酶標二抗(購自北京吉比埃生物技術有限公司)50μ I/孔，再本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種嘔吐毒素雜交瘤細胞株D?2?1CGMCC?No.5161。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：何方洋，韓黎，吳鵬，馮才偉，羅貴昆，韓雪琳，孫震，趙正苗，李勇，陳勇，馮才茂，羅曉琴，
申請(專利權)人：北京勤邦生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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