本發明專利技術涉及一種單克隆抗體及其應用，尤其是呋喃它酮代謝物衍生物單克隆抗體及其應用，屬于免疫化學技術領域。本發明專利技術的呋喃它酮代謝物衍生物單克隆抗體4B10’是由小鼠雜交瘤細胞株4B10產生，其亞型是IgG1型。本發明專利技術的有益效果是：通過小鼠雜交瘤細胞株4B10產生的單克隆抗體4B10’，能夠大量生產，可用于制備檢測呋喃它酮代謝物的酶聯免疫分析法試劑盒和膠體金試紙條，達到快速且靈敏地檢測肌肉、牛奶、及水產品中的呋喃它酮代謝物的目的。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種單克隆抗體及其應用，尤其是呋喃它酮代謝物衍生物單克隆抗體及其應用，屬于免疫化學
技術介紹
硝基呋喃類藥物是人工合成的廣譜抗生素，它有非常好的抗菌作用和藥動力學的特征，曾經被廣泛應用作為畜、禽、人工養殖水產品的促生長添加劑。但通過長期的實驗室研究發現，硝基呋喃類藥物和代謝物均可使實驗動物發生癌變和基因突變，并由此推斷，人類長期使用該類藥物或長期食用添加該類促生長劑的畜、禽、人工養殖水產品，同樣也可發生癌變和基因突變，所以此類藥物禁止在治療動物疾病和飼料中使用。我國于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令，在農業部發布的193號公告的《食品動物禁用獸藥及其它化合物清單》中，硝基呋喃類抗生素在所有食品動物和所有用途中都被禁止使用。歐盟委員會于2003年通過了 2003/181/EC委員會決議，建立了用于檢測禽肉產品和水產品中硝基呋喃類藥物的代謝物和各種方法的最小要求性能限值 (Minimum Required Performance Limits, MRPL)為 I μ g/kg,歐盟從第三國進口的動物性產品中硝基呋喃類藥物的代謝物的含量不得超過I μ g/kg。2004年美國FDA公布了禁止在進口動物源性食品中使用的11種藥物名單，其中包括呋喃它酮。因此，為確保動物源性食品的安全和對外出口貿易的發展，必須確立準確可靠，靈敏度高的定性定量方法。據申請人了解，申請號為200610127111.4，申請日為2006年9月7日，名稱為《單克隆抗體介導的呋喃它酮殘留檢測方法及其應用》的中國專利技術專利申請中，公開了利用呋喃它酮的單克隆抗體檢測呋喃它酮殘留，由于呋喃它酮在體內很快就能被代謝，而在組織中結合的代謝產物是5-嗎啉基甲基-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)則能存留較長的一段時間，所以該方法不能夠準確地檢測呋喃它酮的殘留。因此在分析此類藥物的殘留時經常要分析其代謝后的產物，檢測監管部門就以檢測代謝物為手段達到檢測呋喃它酮殘留的目的。目前用于呋喃它酮殘留標示物AMOZ的檢測方法有液液萃取-高效液相色譜、固相萃取_高效液相色譜法、 液相色譜質譜聯用儀方法等。由于儀器方法所需儀器價格昂貴，耗時長，對操作人員的要求較高，難于在基層單位推廣，不適合高通量的樣品快速篩選。
技術實現思路
本專利技術要解決技術問題是針對以上現有技術存在的缺點，提出一種呋喃它酮代謝物衍生物的單克隆抗體，并將該單克隆抗體應用于檢測呋喃它酮代謝物殘留。該方法具有操作簡便、成本低廉、高通量、特異性強的特點。本專利技術所涉及的雜交瘤細胞株4B10已于2011年7月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號是CGMCC No. 5073，分類命名為抗呋喃它酮代謝物衍生物單克隆抗體的雜交瘤細胞株。由以上雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體命名為4B10’，其制備步驟如下a.制備免疫原和包被原采用間醛基苯甲酸法將載體蛋白與呋喃它酮代謝產物小分子偶聯，合成免疫原和包被原；b.動物免疫注射以Balb/c鼠作為免疫動物，免疫途徑為頸背部皮下多點注射，融合前的超強免疫途徑為腹腔免疫；c.篩選動物免疫血清用間接酶聯免疫吸附法和競爭間接酶聯免疫吸附法篩選免疫鼠血清；d.制備雜交瘤細胞取小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合,經過亞克隆獲得可以穩定分泌抗呋喃它酮代謝物衍生物單克隆抗體的雜交瘤細胞株4B10 ；e.制備并純化單克隆抗體對小鼠腹腔注射雜交瘤細胞4B10，采集腹水，對腹水進行液相層析純化，獲得呋喃它酮代謝物衍生物單克隆抗體4B10’。其中，步驟a所述載體蛋白為牛血清白蛋白和卵清白蛋白，對應的免疫原為 AMOZ-BSA,包被原為AMOZ-OVA ;所述間醛基苯甲酸法中，交聯劑活化載體小分子衍生物的時間為廣2 h，用呋喃它酮代謝物小分子衍生物與載體蛋白偶聯反應1(T15 h。所述步驟b 中的各次免疫注射劑量為100 μ g/只。所述步驟e中對免疫小鼠腹腔進行單克隆抗體細胞株的注射量為(I 5) X IO6個/只。通過亞型鑒定得出本專利技術單克隆抗體的亞型為IgGl型。常規制備呋喃它酮代謝物衍生物單克隆抗體的方法主要是通過藥物的羧基與載體蛋白的氨基偶聯，本專利技術是將呋喃它酮代謝物小分子通過間醛基苯甲酸進行衍生化并將衍生產物的羧基通過混合多元酸酐法與載體蛋白的氨基偶聯，這樣，該法合成的完全抗原， 通過“交聯臂”間醛基苯甲酸的作用，可以將呋喃它酮代謝物小分子充分暴露出來，使機體更容易識別該抗原決定簇，提高抗原的免疫原性，在后期篩選過程中可以獲得針對呋喃它酮代謝物衍生物的抗體。呋喃它酮代謝物衍生物結構式如下HOOC 本專利技術的再一個目的是提供該單克隆抗體在制備檢測呋喃它酮代謝物中的應用，主要是將其應用于制備呋喃它酮代謝物殘留的檢測試劑盒和膠體金試條紙。本專利技術的有益效果是通過小鼠雜交瘤細胞株4B10產生的單克隆抗體4B10’，該抗體與其它呋喃類代謝物衍生物交叉反應率低，能夠大量生產，并可用于制備檢測呋喃它酮代謝物的酶聯免疫分析法試劑盒和膠體金試紙條，達到快速、特異、且靈敏地檢測牛奶， 肌肉及水產品中的呋喃它酮代謝物殘留的目的，為檢測呋喃它酮代謝物殘留的試劑盒研制奠定基礎。附圖說明圖I為本專利技術實施例一中免疫原的OD335標準曲線。圖2為本專利技術實施例一中包被原的OD335標準曲線。具體實施方式實施例一試劑與材料準備鹽酸呋喃它酮(AM，上海安譜科學儀器有限公司，C13963000)呋喃它酮代謝物(ΑΜ0Ζ， 上海安譜科學儀器有限公司，⑶E0-NF003);間醛基苯甲酸(Alfa B21277) ；DMF (sigma, D4551)，牛血清白蛋白(BSA) (Jackson，001-000-173)，卵清白蛋白(OVA) (Sigma, A5503), 弗氏完全佐劑(Sigma, F5881)，弗氏不完全佐劑(Sigma, F5506)，四甲基聯苯胺(TMB) (Amresco, 0759)，HAT (Sigma, H0262)和 HT (Sigma, H0137)，氯化鈉(Amresco, 0241)，氯化鉀(Amresco, 0395),磷酸二氫鉀(Sigma, P9791),磷酸氫二鈉(Sigma, 71639),羊抗鼠 IgG-HRP (Jackson, 115-035-044)，二甲基亞砜(DMSO) (Applichem, 0231)，聚乙二醇 4000 (PEG4000) (Sigma, P7306), DMEM 高糖培養基(Gibco，11995)，胎牛血清(Gibco, C20270)。實驗動物與細胞Balb/c鼠(6-8周齡，雌性)，購自揚州大學動物中心，SP2/0 (小鼠骨髓瘤細胞)由中科院生物物理研究所感染與免疫研究中心唐捷教授惠贈。本專利技術的實驗步驟如下a. 制備免疫原AMOZ-BSA和包被原AM0Z-0VA 本專利技術所述的人工抗原采用間醛基苯甲酸法將AOMZ衍生化，并利用AMOZ衍生物上的羧基和載體蛋白上的氨基進行偶聯，從而合成呋喃它酮抗原。—、完全抗原合成I、將2 mg呋喃它酮代謝產物小分子標準品與2. 7 mg間醛基苯甲酸在I. 5 mL吡啶溶液中15°C震蕩反應24 h。2、將反應液經旋轉蒸發儀蒸干后溶于本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種產生呋喃它酮代謝物衍生物的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4B10，是小鼠雜交瘤細胞系CGMCC？No.5073。
【技術特征摘要】
...
【專利技術屬性】
技術研發人員：唐宏，崔迎利，王曉艷，
申請(專利權)人：泰州康正生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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