一種高效表達(dá)大豆過氧化物酶基因工程菌的構(gòu)建方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種高效表達(dá)大豆過氧化物酶基因工程菌的構(gòu)建方法，該方法是指先從大豆根中提取總RNA，通過RT-PCR獲得總mRNA的cDNA，用sbp基因特征引物，PCR擴(kuò)增獲得sbp基因并測(cè)定其序列；其次用連續(xù)易錯(cuò)PCR的方法突變sbp基因，構(gòu)建出sbp基因隨機(jī)突變文庫；最后將此突變基因在Pichiapastoris表達(dá)系統(tǒng)中分泌型表達(dá)SBP，采用微孔板篩選法篩選出高效表達(dá)SBP的基因工程菌。本發(fā)明專利技術(shù)具有生產(chǎn)大豆過氧化物酶成本低、表達(dá)量高、篩選速度快的特點(diǎn)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及基因工程
，尤其涉及。
技術(shù)介紹
大豆過氧化物酶(SBP)與辣根過氧化物酶同屬于以血紅素為輔基的III類過氧化物酶(EC1. 11. 117)，結(jié)構(gòu)和功能非常相似。目前辣根過氧化物酶已經(jīng)作為一種商品化試劑廣泛用于免疫測(cè)定技術(shù)、電鏡技術(shù)、酶聯(lián)反應(yīng)和免疫印跡等生物學(xué)研究，同時(shí)在生物傳感器、木素降解、工業(yè)“三廢”處理等方面也有應(yīng)用，所以大豆過氧化物酶同樣有著廣泛的應(yīng)用前景。同時(shí)大豆過氧化物酶所具有的底物作用范圍廣、耐熱性能高、酸堿穩(wěn)定性好、PH適用范圍寬等優(yōu)點(diǎn)是辣根過氧化物酶不可比擬的，所以大豆過氧化物酶很可能會(huì)成為辣根過氧化物酶一個(gè)最有競(jìng)爭(zhēng)力的替代品，成為過氧化物酶的一個(gè)很好的來源。對(duì)大豆過氧化物酶的研究可以追溯到1981年DvadiJ. Sesas和Robert LAndero的純化和簡(jiǎn)單性質(zhì)的研究。但直到上世紀(jì)九十年代中期開始，人們對(duì)SBP的研究才逐漸重視起來。1997年美國的Ameriena Qualex和Enzymol International公司將SBP應(yīng)用于醫(yī)藥診斷試劑盒生產(chǎn)，用于診斷病毒、細(xì)菌、寄生所引起的疾病，包括AIDS和瘧疾。SBP-試劑盒的性能和質(zhì)量均高于傳統(tǒng)的HRP-試劑盒，其常溫下存儲(chǔ)期超過一年，遠(yuǎn)高于HRP的4個(gè)月。1999年P(guān)ieree Chemieal公司出售馬來酞亞胺活化的大豆過氧化物酶(EZ-Likn TMMaleimide Aetivated Soybean peroxidase)用于診斷試劑。活化的SBP在與抗體結(jié)合時(shí)只需要一步反應(yīng)就能制備高質(zhì)量的酶結(jié)合物，大大方便了 SBP在各種診斷試劑中應(yīng)用的研究。Caza等人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SBP能有效去除污水中幾種不同的酹類化合物，當(dāng)pH=7. O, SBP在PEG的作用下能去除污水中95%多的酚類化合物，這個(gè)性質(zhì)極大彌補(bǔ)了傳統(tǒng)污水處理中活性泥不能去除有毒物質(zhì)及選擇性不高的缺點(diǎn)。Kostic把SBP裝在特殊處理的多孔玻璃板中進(jìn)行污水處理，不僅解決了 SBP不能重復(fù)使用的缺陷，且加強(qiáng)了 SBP的選擇性。現(xiàn)在美國環(huán)保部門己經(jīng)應(yīng)用SBP來處理工業(yè)廢水。大豆過氧化物酶作為天然酶蛋白，其催化效率、底物親合性、穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)均有待進(jìn)一步提高。利用分子進(jìn)化的手段對(duì)大豆過氧化物酶基因、sbp)進(jìn)行改造，改善其酶學(xué)性質(zhì)，可以更好地適應(yīng)工業(yè)應(yīng)用要求。易錯(cuò)PCR以其操作簡(jiǎn)便、有效等優(yōu)點(diǎn)成為目前應(yīng)用最為廣泛的進(jìn)化手段之一。在酵母中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)或在大腸桿菌中進(jìn)行融合表達(dá)是基因工程生產(chǎn)的兩種主要策略。大腸桿菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表達(dá)系統(tǒng)，它最突出的優(yōu)點(diǎn)是工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高、周期短、生產(chǎn)成本低。然而，許多蛋白質(zhì)在翻譯后，需經(jīng)過翻譯后的修飾加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等過程才能轉(zhuǎn)化成活體形式。大腸桿菌缺少上述加工機(jī)制，不適合用于表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastor is)是近幾年發(fā)展起來的較為完善的、被廣泛用來表達(dá)外源蛋白的甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)。它不但克服了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)不能表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白、表達(dá)的蛋白多形成不溶性包涵體、背景蛋白多、表達(dá)產(chǎn)量低等缺陷；而且彌補(bǔ)了哺乳類細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)操作復(fù)雜，表達(dá)水平低，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)造價(jià)昂貴的不足；與其他酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，具有表達(dá)量高、穩(wěn)定性好、培養(yǎng)成本低、安全可靠、可大體積高密度連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)等獨(dú)特的優(yōu)越之處。同時(shí)，作為真核表達(dá)系統(tǒng)，巴斯德畢赤酵母可對(duì)目的蛋白進(jìn)行翻譯后加工和修飾，即信號(hào)肽剪切、二硫鍵形成、蛋白的糖基化和磷酸化等過程，使外源蛋白得到正確的折疊和修飾。另外，由于該表達(dá)系統(tǒng)有多種受體菌和表達(dá)載體供選擇，可進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)或分泌表達(dá)，有利于產(chǎn)物的提取和加工。迄今為止，大豆過氧化物酶的主要來源是從大豆種皮中通過物理或化學(xué)方法提取、分離、純化。用這種方法制備SBP既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，合成成本高，生物資源浪費(fèi)大，純化困難，獲得的產(chǎn)品價(jià)格昂貴，因此迫切需要研制一種高效廉價(jià)制備SBP的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是提供一種成本低、表達(dá)量高、篩選速度快的高效表達(dá)大豆過氧化物酶基因工程菌的構(gòu)建方法。 為解決上述問題，本專利技術(shù)所述的，包括以下步驟 ⑴野生型sbp基因的克隆與檢測(cè)從大豆根中提取總RNA，通過RT-PCR獲得的cDNA，用設(shè)計(jì)的^如基因特征引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得野生型基因，經(jīng)質(zhì)量體積比為1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA片段； ⑵pPICZa-A-1/7重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定用限制性內(nèi)切酶通和及^/按雙酶切法將所述野生型sbp基因連接到pPICZa-A質(zhì)粒中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZa-A-1p ;再用CaCl2法將所述pPICZa-A-·^/ 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E. coli DH5a,最后篩選陽性克隆體并對(duì)該陽性克隆體進(jìn)行測(cè)序； (3)野生型sbp基因在Pichia pastor is GSl 15酵母中的表達(dá)利用InvitrogenCorporation提供的Pichia pas tor is表達(dá)系統(tǒng)，采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pPICZ a -k-sbp轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞PicAia pas tor is GSl 15中，培養(yǎng)2 3天得到GSl 15陽性克隆；將所述GSl 15陽性克隆接種至BMGY培養(yǎng)基中，12 18h后得到菌液A ;將100 μ I所述菌液A轉(zhuǎn)接到100 ml BMMY培養(yǎng)基中，在甲醇誘導(dǎo)下分泌表達(dá)野生型基因，獲得了具有生物活性的SBP ;其中所述BMMY培養(yǎng)基的pH值為6. O ;甲醇與BMMY培養(yǎng)基的體積比為O. 75% ；誘導(dǎo)時(shí)間為48h ； 敗sbp基因隨機(jī)突變文庫的構(gòu)建將采用連續(xù)易錯(cuò)PCR法獲得的突變型基因與質(zhì)粒載體pPICZ a -A分別用限制性內(nèi)切酶通和油a/按雙酶切法進(jìn)行酶切，經(jīng)T4DNA酶進(jìn)行催化連接反應(yīng)，得到突變重組質(zhì)粒pPICZ a -ksbp,該突變重組質(zhì)粒pPICZ a -ksbp用CaCl2法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α中，構(gòu)建出sbp隨機(jī)突變文庫； (5)高效表達(dá)大豆過氧化物酶基因工程菌的篩選將所述如隨機(jī)突變文庫用限制性內(nèi)切酶SacI線性化后采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞PicAia pastor is GSl 15中，培養(yǎng)2 3天得到GSl 15陽性克隆；將所述GSl 15陽性克隆接種至BMGY培養(yǎng)基中，12 18h后得到菌液B ；將所述菌液B轉(zhuǎn)入設(shè)有BMMY培養(yǎng)基和甲醇的48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在甲醇誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)；然后用96孔酶標(biāo)儀測(cè)SBP活性，當(dāng)該SBP活性為所述步驟⑶中由野生型4/7基因獲得的SBP活性的f 2倍時(shí)，即得到高效表達(dá)大豆過氧化物酶基因工程菌SBP菌株；其中所述BMMY培養(yǎng)基的pH值為6. O ;1 μ I菌液B接種到I ml BMMY培養(yǎng)基中；甲醇與IBMMY培養(yǎng)基的體積比為O. 75% ;誘導(dǎo)時(shí)間為48h。所述步驟⑴中的sbp基因特征引物是指上游引物 Pl :5' CCGCTCGAGACTCAAGCTTCTAGGATTTGTGCC 3'；下游引物 P2:5' GCTCTAGATTACCACTTATTCCATCGCACATACAAC 3'。本專利技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本專利技術(shù)通過分子進(jìn)化的方法對(duì)大豆過氧化物酶基因進(jìn)行改造，改善其酶學(xué)性質(zhì)，大大本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種高效表達(dá)大豆過氧化物酶基因工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：⑴野生型sbp基因的克隆與檢測(cè)：從大豆根中提取總RNA，通過RT?PCR獲得的cDNA，用設(shè)計(jì)的sbp基因特征引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得野生型sbp基因，經(jīng)質(zhì)量體積比為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA片段；⑵pPICZa?A?sbp重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定：用限制性內(nèi)切酶Xho1和XbaI按雙酶切法將所述野生型sbp基因連接到pPICZa?A質(zhì)粒中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZa?A?sbp；再用CaCl2法將所述pPICZa?A?sbp轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli?DH5a，最后篩選陽性克隆體并對(duì)該陽性克隆體進(jìn)行測(cè)序；⑶野生型sbp基因在Pichia?pastoris?GS115酵母中的表達(dá)：利用Invitrogen?Corporation?提供的Pichia?pastoris表達(dá)系統(tǒng)，采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pPICZα?A?sbp轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞Pichia?pastoris?GS115中，培養(yǎng)2~3天得到GS115陽性克隆；將所述GS115陽性克隆接種至BMGY培養(yǎng)基中，12~18h后得到菌液A；將100μl所述菌液A轉(zhuǎn)接到100?ml?BMMY培養(yǎng)基中，在甲醇誘導(dǎo)下分泌表達(dá)野生型sbp基因，獲得了具有生物活性的SBP；其中所述BMMY培養(yǎng)基的pH值為6.0；甲醇與BMMY培養(yǎng)基的體積比為0.75%；誘導(dǎo)時(shí)間為48h；⑷sbp基因隨機(jī)突變文庫的構(gòu)建：將采用連續(xù)易錯(cuò)PCR法獲得的突變型sbp基因與質(zhì)粒載體pPICZα?A分別用限制性內(nèi)切酶Xho1和XbaI按雙酶切法進(jìn)行酶切，經(jīng)T4DNA酶進(jìn)行催化連接反應(yīng)，得到突變重組質(zhì)粒pPICZα?A?sbp，該突變重組質(zhì)粒pPICZα?A?sbp用CaCl2法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，構(gòu)建出sbp隨機(jī)突變文庫；⑸高效表達(dá)大豆過氧化物酶基因工程菌的篩選：將所述sbp隨機(jī)突變文庫用限制性內(nèi)切酶SacI線性化后采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞Pichia?pastoris?GS115中，培養(yǎng)2~3天得到GS115陽性克隆；將所述GS115陽性克隆接種至BMGY培養(yǎng)基中，12~18h后得到菌液B；將所述菌液B轉(zhuǎn)入設(shè)有BMMY培養(yǎng)基和甲醇的48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在甲醇誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)；然后用96孔酶標(biāo)儀測(cè)SBP活性，當(dāng)該SBP活性為所述步驟⑶中由野生型sbp基因獲得的SBP活性的1~2倍時(shí)，即得到高效表達(dá)大豆過氧化物酶基因工程菌SBP菌株；其中所述BMMY培養(yǎng)基的pH值為6.0；1μl菌液B接種到1?ml?BMMY培養(yǎng)基中；甲醇與lBMMY培養(yǎng)基的體積比為0.75%；誘導(dǎo)時(shí)間為48h。...

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王黎，曾家豫，廖世奇，袁紅霞，毛愛紅，馬瑾，田彩平，魏政麗，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：