本發明專利技術為一種大麥種資資源的分子標記方法，屬于植物分子育種領域。大麥種質資源進行磨粉和酶液粗提，并用化學顯色的方法進行LOX-1活性鑒定，最終篩選出LOX-1活性缺失的自然變異材料。根據已經報道的LOX-1基因序列，設計基因特異性引物，對自然變異和活性正常材料的基因組DNA進行PCR擴增利克隆測序，最終確定導致LOX-1活性缺失的突變位點；同時，從發芽后的大麥組織中提取mRNA，反轉錄為cDNA，對上述功能突變材料的LOX-1基因進行測序，并將篩選出的目的基因進行序列比對和功能缺失原因分析，進一步開發出改功能位點的多態性分子標記，實驗驗證該分子標記用于輔助育種的可靠性和有效性。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種大麥脂肪氧化酶(L0X-1)合成缺陷的基因變異及其應用。
技術介紹
以脂肪氧化酶(Lipoxygenase, L0X)為核心的脂質降解途徑是影響以大麥為主要原料的諸如啤酒等飲料的風味的一項重要因素，同時，也是導致谷物儲藏期間品質變劣、產生陳味的根源。在啤酒工業中，反式-2-壬烯醛(T2N)是由脂質降解產生的一種典型的風味老化物質，被認為是啤酒老化的指示劑，嚴重影響啤酒長期儲存的商品性(劉明麗等2011，釀酒科技5:98-102)。在脂質降解途徑中，脂肪氧化酶分別將亞油酸轉化為9-氫過氧化十八碳二烯酸(9-HP0D)和13-氫過氧化十八碳二烯酸(13-HP0D)的雙加氧作用。在釀酒工業中，9-HP0D為主要的脂肪氧化酶通路代謝產物，通過進一步酶促或自發反應導致反式-2-壬烯醛(T2N)的產生(Kuroda 等 2003，Biosci Biotechnol Biochem 67:691-697)。在谷物儲藏過程中，脂肪氧化酶促 進氧元素與多鏈不飽和脂肪酸結合，形成雙鏈的氫過氧化物，進一步轉變成一些揮發性的醛、酮類氣體化合物，從而導致谷物變質和變味；缺失脂肪氧化酶的稻米與未缺失的品種相比耐儲藏性更好，同時品質、發芽率更高，蟲害率更低(Zhang 等 2007, Journal of Stored Products Research 43:87-91)。目前，大麥中已知有 3 個脂肪氧化酶基因(Lox-1 或 LoxA,Lox_2 或 LoxC 以及 Lox_3 或 LoxB) (Van Mechelen等1999，Plant Mol Biol.39(6): 1283-1298)，其中Lox-1是影響大麥麥芽脂肪氧化酶活性的主要基因(Kuroda等2005，EBC Congress，750-756)。已有報道稱，經通過人工誘變獲得的L0X-1基因失活的變異(US20030167544A1)，此外還有篩選種質資源發掘到的自然變異(Hirota等2005, Theor Appl Genet, 111:1580-1584),并隨即用于高品質啤酒大麥新品種的選育。研究表明，這些L0X-1基因失活的大麥原料均可顯著降低啤酒中T2N的含量，經過長時間儲存也不會顯著增加，從而保證啤酒風味不發生改變(US20090285932A1)。目前丹麥嘉士伯啤酒公司以及日本札幌啤酒有限公司已分別經過人工化學誘變以及篩選自然的L0X-1基因合成缺陷型突變體，并對相關基因變異申請了專利保護。
技術實現思路
針對上述現有技術的缺點，本專利技術從中國大麥品種中發掘出的L0X-1合成缺陷型自然變異，位于第二內含子中，與其他已有報道的變異位點均不屬于同一位點，為新的基因變異類型，且已同步開發出特異的功能性分子標記用于輔助快速育種。為實現本專利技術的目的，從大麥種質資源中篩選獲得脂肪氧化酶活性缺失的自然變異材料，進一步獲得L0X-1基因突變位點，并開發相應的單核苷酸多態性分子標記(SNPMarker)。具體地說，對1000份原產于我國的大麥種質資源進行磨粉和酶液粗提，并用化學顯色的方法進行L0X-1活性鑒定，最終篩選出L0X-1活性缺失的自然變異材料。根據已經報道的L0X-1基因序列，設計基因特異性引物，對自然變異和活性正常材料的基因組DNA進行PCR擴增和克隆測序，最終確定導致LOX-1活性缺失的突變位點；同時，從發芽后的大麥組織中提取mRNA，反轉錄為cDNA，對上述功能突變材料的L0X-1基因進行測序，并將篩選出的目的基因進行序列比對和功能缺失原因分析。進一步開發出改功能位點的多態性分子標記，實驗驗證該分子標記用于輔助育種的可靠性和有效性。大麥粗提蛋白的脂肪氧化酶活性分析結果顯示，第二內含子中642bp處的單個堿基突變(G型)的大麥種質資源L0X-1活性缺失，而對照的正常的野生型(C型)則表現為活性正常，說明這是進行L0X-1活性缺失大麥新品種選育的新的基因資源。此外，本專利技術通過開發該SNP位點的特異性分析標記，可用于分子標記輔助育種。采用L0X-1活性缺失的啤酒大麥原料，能夠使釀酒者生產出即使經長期儲藏，T2N特異性的陳腐異味水平也不明顯增加的啤酒；并能夠輔助培育耐儲藏的高品質食用大麥(青稞)和飼用大麥新品種。附圖說明圖1為L0X-1活性缺失材料的篩選示意2為大麥脂肪氧化 酶基因L0X-1的基因結構及其功能變異位點樣品I 4為大麥L0X-1活性缺失型大麥品種(G型)；5_8為活性正常大麥品種(C型)圖3為Loxl基因組第二內含子單堿基變異導致內含子剪切位點改變示意4為Loxl基因第二內含子剪切位點改變導致所編碼蛋白變異的示意圖樣品1-3 (G型)的Lox-1基因由于發生移碼突變和提前終止，導致編碼L0X-1蛋白失活；樣品4 (G型)的Lox-1基因由于發生提前終止，導致編碼L0X-1蛋白失活；樣品5_8 (C型)的Lox-1基因可編碼有活性的L0X-1蛋白；圖5為Lox-1基因SNP特異性分子標記檢測不同大麥樣品的電泳圖譜M:分子量標準(2000bp Ladder);樣品I 4為大麥Loxl基因的突變型大麥品種(G型)，其PCR產物(Loxl.FL.2F/RNR)為720bp ;樣品5_8為沒有突變的野生型大麥品種(C型)，其PCR產物(RNF/Loxl.FL.1R)為320bp ;樣品9-12為雜交種(Fl型)，其PCR產物兩條電泳譜帶均有。具體實施例方式下面結合附圖對本專利技術作進一步的詳細說明。1.大麥L0X-1突變材料的快速定性篩選稱取0.1g的大麥粉溶于Iml的蒸餾水中，用渦旋震蕩器混合均勻后，3000rpm離心2min,取50ul上清至另一 2ml的離心管中；向2ml的離心管中一次加0.5ml的A溶液(10ml 20mmDMAB/100mm磷酸緩沖液,0.4mI 25mm亞油酸底物和9.6ml雙蒸水,現用現配,避光保存)，反應20分鐘，再加入0.5ml的B溶液(0.4ml IOmm MBTH, 0.4ml 5mg/ml血紅蛋白，19.2ml雙蒸水，現用現配，避光保存)反應10分鐘，最后用0.5ml I %的SDS終止反應。如果離心管中呈深藍色，表明L0X-1活性正常，如果呈現淺藍或者無色，表明L0X-1活性低或者無活性。最終篩選到4份L0X-1活性缺失的大麥種質。2.大麥L0X-1突變材料和野生型材料的DNA提取和基因組序列的獲取取0.1g發芽后的新鮮大麥葉片，液氮速凍研磨后采用標準CTAB法進行大麥DNA提取，經RNA酶純化后定量稀釋為50ng/ul的工作液；根據NCBI數據庫中的Lox-1基因組序列(GenBank:L35931.1)，采用Primer 3在線引物設計服務器，設計覆蓋整個基因編碼區的PCR引物(表I)，并采用ABI 3900基因合成儀合成相應寡核苷酸探針。以上述提取的DNA工作液為模板，利用Taq聚合酶對這些大麥材料的Lox-1基因進行PCR擴增和克隆測序。PCR 擴增反應的條件為 95°C 3min, (95°C 20s, 58°C 20s, 72°C 2min)共 35 個循環，72°C延伸7min后終止反應。表I本專利技術用于基因組DNA和cDNA克隆測序及SNP鑒定的引物列表本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種大麥脂肪氧化酶(LOX?1)合成缺陷基因的多態性分子標記方法，其特征在于包括以下步驟：對大麥種質資源進行磨粉和酶液粗提，并用化學顯色的方法進行LOX?1活性鑒定，篩選出LOX?1活性缺失的自然變異材料，設計基因特異性引物，對自然變異和活性正常材料的基因組DNA進行PCR擴增和克隆測序，最終確定導致LOX?1活性缺失的突變位點；同時，從發芽后的大麥組織中提取mRNA，反轉錄為cDNA，對上述功能突變材料的LOX?1基因進行測序，并將篩選出的目的基因進行序列比對和功能缺失原因分析，進一步開發出改功能位點的多態性分子標記，其中基因組DNA測序引物為：Lox1.1?GTCCGATCCATCTCTCCAAA?TCGATCTGCACCAAACCATALox1.2?CTTTCATTTTCACCGCCTTC?GGCACGTAGATCTGCTCCALox1.3?CGCTACGACGTCTACAACGA?GCGCGTTTCAATCAATCATALox1.4?GTACGTTCTCCACGGTCGAT?AGCAATTCGTTCCGCTTAAAcDNA克隆測序引物：Lox1.FL1?AGCAGTGAAAGCGAGGAGAG?TGATGGAGTAGCCCAGGAAGLox1.FL2?CGCCAACTCATGGATCTACC?GAACGCCCTTTATTCATCCASNP鑒定引物：RNR?CACTAGTGATTCTGCGAGTGTGGAGCCCRNF?AAAACATAACTTTTTAATAGTAATGTTGCAC。...
【技術特征摘要】
1.一種大麥脂肪氧化酶(LOX-1)合成缺陷基因的多態性分子標記方法，其特征在于包括以下步驟:對大麥種質資源進行磨粉和酶液粗提，并用化學顯色的方法進行L0X-1活性鑒定，篩選出L0X-1活性缺失的自然變異材料，設計基因特異性引物，對自然變異和活性正常材料的基因組DNA進行PCR擴增和克隆測序，最終確定導致L0X-1活性缺失的突變位點；同時，從發芽后的大麥組織中提取mRNA，反轉錄為cDNA，對上述功能突變材料的L0X-1基因進行測序，并將篩選出的目的基因進行序列比對和功能缺失原因分析，進一步開發出改功能位點的多態性分子標記，其中基因組DNA測序引物為:Loxl.1 GTCCGATCCATCTCTCCAAA TCGATCTGCACCAAACCATALoxl.2 CTTTCATTTTCACCGCCTTC GGCACGTAGATCTGCTCCALoxl.3 CGCTACGACGTCTACAACGA GCGCGTTTCAATCAATCATALoxl.4 GTACGTTCTCCACGGTCGAT AGCAATTCGTTCCGCTTAAAcDNA克隆測序引物:Loxl.FLl AGCAGTGAAAGCGAGGAGAG TGATGGAGTAGCCCAGGAA...
【專利技術屬性】
技術研發人員：郭剛剛，張京，張云霞，周芝輝，袁興淼，
申請(專利權)人：中國農業科學院作物科學研究所，
類型：發明
國別省市：北京;11
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