大豆脂肪氧化酶Lox2的單克隆抗體雜交瘤細胞株及其抗體和應用制造技術

本發明專利技術公開了抗大豆脂肪氧化酶Lox2的單克隆抗體雜交瘤細胞株及其抗體和應用，屬于生物檢測技術領域。本發明專利技術的一種抗大豆脂肪氧化酶Lox2的單克隆抗體雜交瘤細胞株，其保藏編號為：CGMCC5122。由本發明專利技術的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體能夠實現對大豆脂肪氧化酶Lox2的特異性檢測，因此，進一步的，本發明專利技術還提出了由該雜交瘤細胞株分泌產生的單克隆抗體及其在檢測大豆脂肪氧化酶Lox2中的應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種單克隆抗體雜交瘤細胞株及其單克隆抗體，特別涉及分別分泌抗大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2和Lox3的單克隆抗體雜交瘤細胞株及其單克隆抗體,細胞株保藏編號分別為CGMCC5121、CGMCC5122及CGMCC5123，還涉及各自分泌的單克隆抗體在利用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(DAS-ELISA)檢測大豆脂肪氧化酶同功酶當中的應用，屬于生物檢測

技術介紹
大豆中含有三種脂肪氧化酶(Lipoxygenase,簡稱Lox)同功酶即Loxl、Lox2和Lox3,它們能專一催化具有cis, cis-1, 4-戍二烯結構的多元不飽和脂肪酸通過分子加氧，形成具有共軛雙鍵的氫過氧化衍生物，即醛、酮等具有揮發性的異味物質，使大豆具有豆腥味，從而降低了豆制品的耐儲性、食用性和營養價值。通常在大豆加工過程中人們通過加熱、微波照射、改變介質的PH值、有機溶劑萃取和醛水解酶等方法消除豆腥味，但這些方法都會不同程度地降低豆制品的營養價值，并且使得成本增高。培育脂肪氧化酶缺失品種可以從根本上解決上述問題。但在脂肪氧化酶缺失材料的選育過程中，Lox在田間不存在指示性狀，從種子外觀和農藝性狀上無法鑒別，并且田間脂肪氧化酶缺失材料選擇工作量大，因此急需一種快速、簡便、成本低、一次可以同時檢測出三種脂肪氧化酶的檢測方法。 目前脂肪氧化酶的常用的檢測方法是薄層等電聚焦電泳(IEF)檢測方法，這種方法主要是通過酶染法和蛋白染色方法結合使Lox同功酶帶顯色，雖然能同時檢測出三種脂肪氧化酶，但檢測中常常會因Lox的缺失而發生其它Lox等電點正極漂移現象；另外該方法所需設備、試劑昂貴，操作要求嚴格，一般育種、倉儲單位和加工質檢部門不便操作。另外據日本Suzuki, Y 等 1992 年報道(Prodution and use ofmonolional antibodies against rice embryo lipoxygenase-3, Biosci Biotech.Biochem. 56:678-679):用單克隆抗體可以檢測水稻中的Lox3,這種方法雖然結果準確可靠，但檢測過程中除需要做封閉外，還需要過夜包被酶標板，因此耗時，操作起來不方便。申請號00112539. 7的專利公開了一種作物脂肪氧化酶同功酶的檢測方法，該方法具有操作簡便、結果直觀等特點。但由于它是利用脂肪氧化酶的偶聯氧化還原指示劑顯色反應的原理來進行測定的，所以它的靈敏度和特異性受到一定的限制。
技術實現思路
本專利技術的目的在于避免上述方法的缺陷，建立能分別分泌抗大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2、Lox3的特異性單克隆抗體的3個雜交瘤細胞株,利用這些細胞株分泌的特異性單克隆抗體來組裝可以用于同時檢測大豆中三種脂肪氧化酶同功酶的雙抗體夾心酶聯免疫吸附(DAS-ELISA)檢測試劑盒。該試劑盒適用于對大豆中三種脂肪氧化酶的定性和定量測定。本專利技術所解決的第一個技術問題是提供了一組抗大豆脂肪氧化酶同功酶的單克隆抗體雜交瘤細胞株，其特征在于所述的單克隆抗體雜交瘤細胞株包括分泌抗大豆脂肪氧化酶Loxl的單克隆抗體雜交瘤細胞株，為小鼠的脾細胞與SP2/0細胞經過細胞融合產生，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC5121 ；及分泌抗大豆脂肪氧化酶Lox2的單克隆抗體雜交瘤細胞株，為小鼠的脾細胞與SP2/0細胞經過細胞融合產生，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC5122 ;及分泌抗大豆脂肪氧化酶Lox3的單克隆抗體雜交瘤細胞株，為小鼠的脾細胞與SP2/0細胞經過細胞融合產生，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC5123。 所述的抗大豆脂肪氧化酶Loxl、Lox2、Lox3的單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立方法如下①免疫抗原制備分別取單缺Loxl的大豆種子(記為Lox-Ι)、單缺Lox2的大豆種子五星2號(記為Lox-2)、單缺Lox3的大豆種子(記為Lox_3) (Lox_l、Lox_3可以通過國家種質庫獲得，五星2號(Lox-2)可以從市場上買到)，用鋼銼磨成豆粉，以及Sigma公司產品Soybean Lox typel_B (同時含有3種大豆脂肪氧化酶,幾乎不含其它大豆蛋白),分別與8 15倍體積的的pH為8. O的Tris — CaCl2緩沖液混勻，浸提O. 5-1小時，4°C 12000rpm離心IOmin,,取上清備用，分別為Lox-1上清液、Lox_2上清液、Lox_3上清液、Soybean Loxtype1-B上清液；②小鼠免疫選擇4 6周齡的行動敏捷的純系BALB/C雌小鼠，分別稱量各小鼠體重并標記；取步驟①中制備的Lox-1、Lox-2、Lox-3上清液，用生理鹽水將其稀釋到蛋白含量4mg/ml，加入等體積弗氏完全佐劑混合后，采取皮下多點注射首次免疫小鼠，各上清液分別免疫5只小鼠并做標記,每只小鼠的免疫劑量為O. 4 O. 6mg ；③注射環磷酰胺溶液(CY):將步驟②中首次免疫的小鼠分別于免疫10min、24h、48h后，按照90mg/kg的量分別對小鼠進行頸背部多點注射濃度20mg/ml的環磷酰胺溶液(CY)進行消減；④效價測定及再次免疫首次免疫I周后用步驟①中制備的Soybean Loxtypel-B上清液作抗原對步驟③中的小鼠按照步驟②方法再次進行免疫，第二次免疫一周后進行第三次免疫，第三次免疫后第四天從小鼠尾部分別取血2-3滴，離心取上清，用間接酶聯免疫吸附法測定其效價(效價測定利用Soybean Lox typel_B包被),如果效價小于1:1600,1周后對各小鼠用Soybean Lox typel_B按照步驟②方法再次進行免疫,并進行效價測定，直至血清效價達到或高于1:1600為止；⑤加強免疫3種免疫小鼠中，每種均選擇血清效價最高的小鼠在細胞融合前3天按步驟④加強免疫I次；⑥細胞融合分別取步驟⑤中的不同小鼠的脾細胞與復蘇的SP2/0細胞混勻，在細胞培養板HAT培養基上分別篩選陽性雜交瘤細胞；⑦特異性陽性細胞株篩選細胞融合7 15天后，采用間接酶聯免疫吸附法，利用Soybean Lox typel_B作為檢測抗原進行陽性篩選，同時利用單缺Loxl的大豆種子(Lox-1)的豆粉上清液作為檢測抗原進行交叉檢測，上清液的0D450值與空白對照孔的0D450值之比大于2.1的即判斷為陽性孔，并且與Lox-1反應表現為陰性的孔，其中的雜交瘤細胞稱為陽性細胞株，該細胞株分泌的單克隆抗體為特異性抗Loxl的。用同樣的方法，均利用Soybean Lox typel_B作為檢測抗原進行陽性篩選,利用五星2號豆粉上清液對分泌抗Lox2的單克隆抗體進行交叉檢測,利用Lox-3豆粉上清液對分泌抗Lox3的單克隆抗體進行交叉檢測；⑧亞克隆采用有限稀釋法對步驟⑦中篩選到的3種陽性細胞株分別進行亞克隆，連續兩次亞克隆之后剔除掉假陽性細胞株，在檢測過程中均按照⑦中的方法同時進行陽性和交叉檢測，最終可以獲得分別分泌抗Loxl、Lox2、Lox3的特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本專利技術所解決的第 二個技術問題是提供由權利要求1所述的單本文檔來自技高網...

【技術保護點】
抗大豆脂肪氧化酶Lox2的單克隆抗體雜交瘤細胞株，其特征在于所述的單克隆抗體雜交瘤細胞株為小鼠的脾細胞與SP2/0細胞經過細胞融合產生，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為：CGMCC5122。

【技術特征摘要】
1.抗大豆脂肪氧化酶L0X2的單克隆抗體雜交瘤細胞株，其特征在于所述的單克隆抗體雜交瘤細胞株為小鼠的脾細胞與SP2/0細胞經過細胞融合產生，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張孟臣，邸銳，楊春燕，趙雙進，蔣春志，閆龍，馬志民，史曉蕾，
申請(專利權)人：河北省農林科學院糧油作物研究所，
類型：發明
國別省市：