一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株制造技術

本發明專利技術公開了一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株，其特征在于：豬傳染性胃腸炎病毒（swine?transmissible?gastroenteritis?virus），CCTCC?NO：V201216。本發明專利技術的豬傳染性胃腸炎病毒滅活后免疫豬只，可以給豬提供有效的保護，是一株比較理想的制苗候選毒株。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于微生物病毒領域，涉及病毒新毒種，具體涉及一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株及其生物學特性。
技術介紹
2012年I月，鄭州市新鄭市某豬場豬群10頭7日齡豬只先后發病，其中一頭小豬在發病兩天后死亡，發病豬臨床癥狀為嘔吐、嚴重腹瀉、脫水。采集發病豬的腸道、淋巴結，置于冰盒中并在24h內送至實驗室。研磨病料，12000 r/min,離心10 min,過濾上清,接種ST細胞，結果分離到一株疑似豬傳染性胃腸炎病毒，經分子水平鑒定后確定其為HN-2012豬傳染性胃腸炎病毒。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株，分類命名豬傳染性胃腸炎病毒 TGEN HN-2012,拉丁文學名swine transmissible gastroenteritis virus,保藏單位中國典型培養物保藏中心，保藏單位簡稱CCTCC，保藏單位地址湖北省武漢市武昌區珞珈山路16號武漢大學，保藏日期2012年4月13日，保藏編號CCTCC NO :V201216。本專利技術的技術方案是一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株，豬傳染性胃腸炎病毒(swine transmissible gastroenteritis virus), CCTCC NO :V201216o所述的豬傳染性胃腸炎病毒毒株具有下述特點 (I)所述毒株在電鏡下顯示呈圓形，有的呈橢圓形或多邊形。有雙層膜，囊膜上覆有花瓣狀纖突。病毒粒子的直徑為90 200 nm，符合豬傳染性胃腸炎病毒粒子的形態特征。`(2)分離的病毒能夠感染ST細胞，出現典型的病變。(3)經豬傳染性胃腸炎病毒陽性血清中和后不能引起細胞病變。(4)所述毒株對乙醚、氯仿和酸敏感；日光下6 h、紫外線照射均能使其滅活；不凝集雞、豚鼠和小鼠的紅細胞。(5)病毒的 TCID5tl 為 I(T7 67A). 2mL。(6)所述毒株的核酸類型是單股RNA病毒。(7)利用TGEV N基因的特異性引物對所述毒株進行PCR擴增并克隆測序，在NCBI上進行blast結果顯示其為TGEV的N基因序列。(S)TGEV N基因全場1171bp，編碼382個氨基酸，同源性結果分析顯示，所述毒株與美國強毒株代表DQ811785同源性最高，為99. 5%。進化樹結果分析顯示，所述毒株與韓國AF302264毒株是一大分支。HN-2012豬傳染性胃腸炎病毒毒株可應用于制備TGEV疫苗的生產毒種。本專利技術的有益效果是本專利技術的HN-2012豬傳染性胃腸炎病毒滅活后免疫豬只，可以給豬提供有效的保護，是一株比較理想的制苗候選毒株。附圖說明圖1為TGEV N基因的測序結果，M =Marker 2000 ；1 =TGEV陽性對照；2 :分離樣品；3 :陰性對照； 圖2為TGEV N基因同源性分析； 圖3為TGEV N基因進化樹分析。具體實施例方式2012年I月，鄭州市新鄭市某豬場豬群10頭7日齡豬只先后發病，其中一頭小豬在發病兩天后死亡，發病豬臨床癥狀為嘔吐、嚴重腹瀉、脫水。其發病表現與國內報道的其他地區發病的豬傳染性胃腸炎癥狀大致相似，初步判斷為豬傳染性胃腸炎。采集發病豬的腸道、淋巴結，置于冰盒中并在24 h內送至實驗室。研磨病料，12000r/min,離心10 min,過濾上清,接種ST細胞,結果分離到一株疑似傳染性胃腸炎病毒,用特異性引物進行分子鑒定后確定其為豬傳染性胃腸炎病毒。·該病毒能夠感·染ST細胞，造成細胞拉網脫落等病變。對所述毒株進行N基因的PCR擴增并克隆測序，NCBI上BLAST得出其為豬傳染性胃腸炎病毒。本專利技術中，毒株定名為TGEV HN-2012。1、流行病學調查2012年I月，鄭州市新鄭市某豬場豬群10頭7日齡豬只先后發病，其中一頭小豬在發病兩天后死亡，發病豬臨床癥狀為嘔吐、嚴重腹瀉、脫水。并且具有傳染性，其發病表現與國內報道的其他地區發病的豬傳染性胃腸炎癥狀大致相似，初步判斷為豬傳染性胃腸炎。采集發病豬的腸道、淋巴結，置于冰盒中并在24 h內送至實驗室。2、病毒分離采集病死豬的空腸及腸系膜淋巴結，用緩沖鹽水或含0.5%乳白蛋白水解物的D-HankJ S液制成1:5 1:10懸液，加入青霉素和鏈霉素各1000 u/ml或1000ug/ml,超聲波出來后,2000 r/min離心沉淀20 min,吸取上清液用濾膜(孔徑0. 2 um)過濾，濾液即為接種材料。接種細胞為豬睪丸細胞(ST細胞)。結果表明最初幾代無細胞病變(CPE)，盲傳至5-6代后出現典型的CPE，表現為細胞聚集、變圓，皺縮，細胞呈拉網狀，最后出現空泡病變。3、病毒PCR鑒定根據GenBank數據庫中已有的豬傳染性胃腸炎病毒的N基因核苷酸序列，用Clustal、DNAstar等生物軟件進行同源性分析后，選出較為保守的核苷酸區域，應用Primer 5. 0設計N基因的特異性引物。參照GENEray高純總RNA快速提取試劑盒的說明書進行，具體操作步驟如下取新鮮的病毒樣品400 U L加入裝有400 V- L Trizol的1. 5 mL RNase-free離心管中混合均勻，劇烈震蕩直到液體清亮；加入100 u L氯仿/異戊醇,劇烈震蕩混勻30 s ;臺式離心機上12000 r/min,離心5 min ;將上清液小心轉到無菌1. 5 mL RNase-free離心管里,加入150 u L無水乙醇，混勻(此處可能會出現絮狀沉淀物);將上述溶液(包括沉淀)轉移到套放于2 mL收集管內的GenClean柱中，室溫放置2 min, 12000 r/min離心I min ;小心取出柱子，棄去收集管中的廢液，將柱子放回收集管中，加入450 UL RPE Solution, 12000 r/min,室溫離心30 s ;重復上一步驟一次；小心取出柱子，棄去收集管中的廢液，將柱子放回收集管中，10000 r/min,室溫離心30 s ;小心取出柱子,放入無菌RNase-free的1. 5 mL離心管里，在柱內膜的中央小心加入40 uL DEPC-H2O, 55 58 °C放置2 min (室溫放置產率約低20%左右)；12000 r/min，室溫離心I min。收集管內的溶液為RNA樣品，可立即使用或者-70°C保存。反轉錄過程，根據Fermentas 公司的 RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit試劑盒說明書進行，具體步驟是取11 uL DEPC處理水溶液中的RNA;oligo (dT)18primer I iiL,70°C水浴 10 min,快速放置冰上 5 min ;按順序加入 5XReaction buffer 4U L, RiboLock RNase Inhibitor I u L, 10 mM dNTP Mix 2 u L,瞬時離心后，放入 42°C水浴 2min ;快速加入 I u L RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase,總體積 20 uL,瞬時離心后繼續放入42 °C水浴60 min, 70 °C水浴15 min,即為反轉錄的cDNA,可立即使用或者-70°C保存。PCR反應體系 cDNA2 UL Premix EX Taq12. 5 U L 上游引物PlI UL本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株，其特征在于：豬傳染性胃腸炎病毒（swine?transmissible?gastroenteritis?virus），CCTCC?NO：V201216。

【技術特征摘要】
1. 一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株，其特征在于豬傳染性胃腸炎病毒(SWine transmiss...

【專利技術屬性】
技術研發人員：胡慧，魏戰勇，崔保安，陳雅君，張莉娟，劉中原，寇亞楠，
申請(專利權)人：河南農業大學，
類型：發明
國別省市：