本發明專利技術公開了一株豬偽狂犬病病毒強毒株、其基因缺失疫苗株及其應用。本發明專利技術分離得到的一株豬偽狂犬病病毒強毒株，命名為HeN1，其微生物保藏編號為CGMCC?NO.6656，在該強毒株HeN1基礎上缺失gE基因獲得了基因缺失疫苗株rPRV-gE--EGFP+，其微生物保藏編號為CGMCC?NO.6657。本發明專利技術的強毒株可制備成滅活疫苗（單苗或聯苗），基因缺失疫苗株rPRV-gE--EGFP+可制備成活疫苗或滅活疫苗（單苗或聯苗）等，都可有效預防或治療豬偽狂犬病，也可將其制備成診斷豬偽狂犬病的診斷試劑。本發明專利技術基因缺失疫苗株rPRV-gE--EGFP+具有安全性好、保護效率高、利于鑒別診斷等優點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一株病毒強毒株以及在其基礎上獲得的基因缺失疫苗株，尤其涉及一株豬偽狂犬病病毒強毒株HeNl、由該強毒株HeNl缺失gE基因獲得的基因缺失疫苗株rPRV-gE_-EGFP+，本專利技術還涉及HeNl和疫苗株rPRV-gE_-EGFP+在預防或治療豬偽狂犬病中的應用，本專利技術屬于生物醫藥領域。
技術介紹
偽狂犬病(Pseudorabies,PR 又名 Aujeszky’s disease, AD)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus, PRV)引起的多種家畜、野生動物、伴侶動物和實驗動物的一種急性傳染病。在自然條件下，本病最常見于豬、牛、羊、犬、貓和鼠類。偽狂犬病病毒除對豬以外，對所有易感動物都是致死性病程。對豬主要表現為神經癥狀、流涎、呼吸困難、繁殖障礙、生長停滯、失重及高死亡率。哺乳仔豬感染偽狂犬病的臨床表現最為典型、嚴重和一致，均出 現神經癥狀、麻痹、衰竭死亡，死亡率幾乎高達100% ;隨著年齡增長死亡率逐漸下降，成豬僅為2%，但一般情況下成豬感染不發病，而呈隱形經過，僅見打噴嚏、咳嗽、體溫升高等輕微癥狀；妊娠母豬感染偽狂犬病毒可引起流產、死胎、產弱仔和木乃伊化胎兒；對公豬可引起睪丸鞘膜炎。該病具有高度的傳染性，一旦在豬群中發現，將很快通過空氣和接觸經呼吸道傳播給其他豬只和豬場，近來的研究表明偽狂犬病病毒還可以通過乳汁和生殖道感染。在規模化豬場，PR是常規免疫防控對象。利用強弱毒鑒別ELISA進行的血清流行病學調查發現，基因缺失疫苗免疫后仍有一定比例的豬場和豬只存在野毒抗體，并偶有病毒分離的報道。由于造成的經濟損失有限，并未引起足夠重視。但近一年來，有多個使用常規疫苗免疫的規模化豬場出現了疑似PR流行的現象，主要表現為母豬產弱仔、死胎，仔豬出現神經癥狀及死亡等。將送檢的組織進行PCR鑒定和病毒分離，證明豬場確實存在PRV野毒感染。目前本實驗室已經從河南、黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古等省豬場送檢的病料中檢測到PRV野毒。由于PRV基因組較大，約145kb，我們從各豬場送檢樣品中通過PCR擴增PRV的gE基因進行了測序，結果表明各豬場流行毒株的這兩個基因高度同源，同源性在99%以上，與PRVKaplan株(匈牙利，GenBank登錄號JQ809328)同源性最低，為97. 5%。免疫接種是防控PRV的最有效方法。我國于上世紀70年代從匈牙利引進了PRVBartha k61株，該病毒是世界上公認的優良疫苗株，國內規模化豬場大都應用該疫苗，PR也得到了很好的控制。但現在的情況是，PR發病豬場都按照常規程序免疫過該疫苗，是否新流行毒株存在抗原變異導致免疫豬不能有效抵抗該病毒？我們利用血清中和試驗和綿羊的免疫接種試驗證實，Bartha k61免疫豬產生的中和抗體不能有效中和新分離病毒，而且免疫Bartha k61的綿羊也不能完全抵抗新病毒的攻擊。因此急需開發新的安全有效的PRV疫苗以應對新流行的毒株。
技術實現思路
本專利技術目的之一是提供一株豬偽狂犬病病毒強毒株。本專利技術目的之二是提供一株由該豬偽狂犬病病毒強毒株經基因工程方法缺失gE基因并插入EGFP標記的弱毒疫苗株，用該弱毒疫苗株所制備的疫苗對于PRV新流行毒株具有良好的保護效力。本專利技術目的之三是提供一種預防或治療豬偽狂犬病的疫苗組合物。本專利技術的上述目的分別是通過以下技術方案來實現的從我國河南省疑似PRV感染的某豬場采集病豬的腦組織，提取組織基因組DNA，利用PRV gE特異性引物進行PCR鑒定(圖1)，將陽性腦組織勻漿液進行離心、過濾取濾液凍存待用。Veix)細胞在37°C下培養48h形成單層后，每瓶接種Iml濾過的病料懸液上清，吸附Ih后，換含2%胎牛血清的DMEM培養液繼續在37°C下培養，觀察3 4天有無細胞病變產生(圖2)。當60 70%細胞出現CPE變化時收毒，將有病變的毒株傳2 3代后用PRVgE的特異性引物進行PCR擴增和病毒粒子電鏡觀察鑒定。試驗表明利用PRV gE特異性引物能夠擴增到預期大小的片段，將該片段測序后與GenBank上發表的序列進行比較，其同 源性在97%以上，其序列結果為SEQ ID N0:2所示。將培養物進行電鏡觀察，可以觀察到病毒粒子呈圓形，有中空和實心兩種特征，有的有囊膜有的無囊膜(圖3)。根據上述結果證明，該分離毒株為PRV，命名為HeNl株，分類命名偽狂犬病病毒，該毒株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，其菌種保藏編號為=CGMCC NO. 6656，保藏日期為2012年10月12日。BALB/c小鼠接種PRV HeNl株后出現了典型的偽狂犬病癥狀用嘴啃咬注射部位，導致局部被毛脫落、皮膚出血、嚴重者后肢被咬斷，注射病毒含量在103_°_106_ciTCID5tl的小鼠在接種后60h內死亡。通過計算PRV HeNl對BALB/c小鼠的LD5tl為23HCID5(I。注射DMEM培養液的對照鼠無異常表現。SPF斷奶仔豬接種PRV HeNl株后只出現一過性發熱反應，體溫達到41°C，持續3-5天，此外無其他臨床發病癥狀和剖檢變化。利用微量中和試驗和綿羊的免疫攻毒試驗證實新分離毒株(PRV HeNl株)與疫苗株Bartha k61之間存在抗原差異。結果發現Bartha k61接種豬產生的中和抗體水平與HeNl接種豬相比普遍較低，其能50%中和自身病毒的血清稀釋度均在1:40以內，對新分離病毒HeNl的中和能力更低，50%中和病毒的血清稀釋度在1: 10左右。HeNl接種豬在感染后2周就能產生高水平的中和抗體，50%中和病毒的血清稀釋度均在1:80以上，而且對兩種病毒的中和能力都較高。通過基因克隆技術以PRV HeNl株的部分gl和Us2基因作為同源臂，以及綠色熒光蛋白基因(EGFP)作為篩選標記構建了轉移載體質粒pU⑶sAB-EGFP，將PRVHeNl基因組和轉移載體共轉染Vero細胞，經過4輪噬斑純化和鑒定證實獲得了缺失gE基因同時插入EGFP標記的重組偽狂犬病病毒rPRV-gE_-EGFP+。通過噬斑試驗和一步生長曲線測定等方法對重組偽狂犬病病毒rPRV-gE_-EGFP+的生長特性進行研究，結果發現重組病毒rPRV-gE__EGFP+在體外細胞培養中的增殖速度與親本毒HeNl株相比沒有明顯差別，說明缺失和插入沒有影響重組病毒在體外的繁殖速度。重組病毒rPRV-gE_-EGFP+在Vero細胞上盲傳12代，綠色熒光蛋白仍能夠穩定表達，通過PCR鑒定可以檢測到插入的外源片段和插入位點兩側的病毒基因序列，表明所獲得的重組病毒rPRV-gE_-EGFP+能夠穩定遺傳。因此本專利技術還提出了一株豬偽狂犬病病毒疫苗株，其特征在于所述的疫苗株是在所述的豬偽狂犬病病毒強毒株的基礎上，通過基因工程方法缺失gE基因并插入EGFP標記得到的。在本專利技術的一個具體實施例中，插入序列及其側翼核苷酸序列為SEQ ID N0:3所/Jn o在本專利技術的一個具體實施例中，所述的豬偽狂犬病病毒疫苗株，命名為rPRV-gE_-EGFP+，分類命名偽狂犬病病毒，該毒株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一株豬偽狂犬病病毒（Porcine?Pseudorabies?Virus，PRV）強毒株，命名為HeN1，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為：CGMCC?NO.6656。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：田志軍，彭金美，安同慶，
申請(專利權)人：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。