不含異源成分的gM-陰性EHV突變體制造技術

本發明專利技術涉及不含異源成分的gM-陰性EHV突變體。本發明專利技術涉及動物健康領域，特別是涉及編碼gM蛋白的基因缺失且不含異源成分的馬皰疹病毒(EHV)。本發明專利技術進一步涉及包含所說病毒的藥用組合物及其應用，以及預防和治療EHV感染的方法。本發明專利技術也涉及包含EHV-1和EHV-4病毒的藥用組合物，其中編碼gM蛋白的基因缺失，并且不含有異源成分。（*該技術在2023年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及動物健康領域，特別是涉及編碼gM蛋白的基因缺失且不含異源成分 (heterologous element)的馬皰疫病毒(Equine Herpes Viruse) (EHV)。本專利技術進一步涉及包含所說病毒的藥用組合物及其應用，以及預防和治療EHV感染的方法。本專利技術也涉及包含EHV-I和EHV-4病毒的藥用組合物，其中編碼gM蛋白的基因缺失，并且不含有異源成分。
技術介紹
馬皰疫病毒I (EHV-1),作為α皰疫病毒亞科(Alphaherpesvirinae)的成員，是馬中病毒引起流產的主要原因，它也可引起呼吸和神經系統疾病。馬皰疹病毒4(EHV-4) 也可引起呼吸系統疾病，流產，或神經系統疾病。已經鑒定出了兩種類(EHV-1:菌株 Ab4p;EHV-4:菌株 NS80567)的 DNA 全序列(Telford, E. A. R. et al.，1992; Telford, E.A.R. et al. , 1998) 0然而，只鑒定出了少數與EHV毒力和免疫原特性相關的基因和基因產品O皰疹病毒的糖蛋白，在病毒感染初期階段，病毒粒子的細胞釋放階段，以及病毒粒子通過與相鄰細胞融合而進行細胞至細胞的直接擴散階段，都扮演了至關重要的作用。迄今為止，已經鑒定出了 11種I型單純皰疹病毒(HSV-I)編碼的糖蛋白，它們命名為 gB, gC, gD, gE, gG, gH, gl, gj, gK, gL 和 gM。缺失了 gC, gE, gG, gl, gj,和 gM 的 HSV-I 突變體是活的，顯示這些基因在培養細胞中對病毒復制是可有可無的。HSV-I和馬皰疹病毒I的核苷酸序列比較顯示，所有的已知HSV-I糖蛋白在EHV-I中都是保守的。按照當前的命名法，這些糖蛋白被以它們的HSV-I同源類似物的名字命名。已知EHV-I的gC，gE和gl不是在細胞培養物中生長所必需的，而gB和gD則是病毒在培養細胞中生長所必需的。其它 EHV-I糖蛋白對在培養細胞中病毒復制所起的作用是未知的(Flowers，C. C. et al.，1992)。 轉錄和蛋白分析顯示，糖蛋白gB, gC, gD, gG, gH和gK可在EHV-I感染的細胞中表達。糖蛋白 gM(由基因 ULlO 表達[Baines, J. D. et al.，1991;Baines, J. D. et al.，1993])是唯一報道的非必要糖蛋白，其在所有的皰疹病毒亞家族中是保守的，并且對于人、小鼠巨細胞病毒，以及Y皰疫病毒亞科成員EHV-2,松鼠猴皰疫病毒(herpesvirus saimiri),以及EB病毒(Epstein-Barr)有記載。與許多皰疹病毒糖蛋白類似，HSV-I gM在病毒粒子和感染細胞的膜上出現。只缺失gM的HSV-I突變體在細胞培養系統中的生長滴度，與野生型病毒相比，大約減少了 10倍，而且在小鼠模型中顯示出了減少的毒力(Baines，J. D. et al.，1991;MacLean, C. A. et al.，1993)。EHV-IgM 同源類似物(gp21/22a;本文中稱為 EHV-IgM)第一次是被Alien和Yeargan (Allen, G. P. et al, 1987)所記載，認為其是病毒包膜的主要成分。進一步的研究顯示，基因52是與HSV-1UL10同源的基因，編碼450個氨基酸的 EHV-I gM 多肽(Pilling, A. et al. , 1994; Telford, E. A. R. et al.，1992)。EHV-I gM 是一個多聚體疏水蛋白，包含有8個預測的跨膜區，據報道在感染細胞和純化病毒粒子中出現，是 Mr 為 45,000 的蛋白(Pilling, A. et al. , 1994; Telford, E. A. R. et al.，1992)。為了控制EHV-I的病毒感染，可以采取兩種不同的方法。第一種，開發修飾的活疫苗(MLVs)，包括廣泛在歐洲和美國中使用的RacH株(Mayr, A. et al.，1968;Hubert, P. H. et al. , 1996) 0第二種，滅活疫苗，以及基于重組表達的病毒糖蛋白亞單位疫苗，如糖蛋白(g)B,C, D,和H，它們可對接下來在模型鼠中EHV-I的感染接種產生部分的保護作用。包含所說糖蛋白的亞單位疫苗，如gB，gC，gD，和gH，只有很弱的抗重復感染的保護作用(Awan et al.,1990, Osterrieder et al. , 1995, Tewari et al. , 1994, Stokes et al, 1996)。本專利技術要解決的技術問題是，提供一種比現有技術疫苗能更好抗EHV感染的改良疫苗。圖I :不含外源序列的gM缺失EHV-IRacH病毒(H Δ gM_w)的構建此圖顯示了病毒的基因圖，和用于構建HAgM-W的質粒。通過插入大腸桿菌 IacZ(HAgM-IacZ)表達框或綠色熒光蛋白(GFP)表達框(HΛ gM_GFP)，首先構建“第一代”ΗΛ gM 病毒。圖 A 顯示了 EHV-I RacH 株的 BamHl 圖譜，包含 gM_0RF 的 BamHI-HindIII 片段在圖B中被放大了，顯示出了該區域的基因組結構。gM缺失病毒一H Δ gM-GFP，攜帶有取代了 EHV-IgM基因主要部分的GFP表達框。圖C記載了在Southern印跡中使用的GFP特異性探針。質粒pBH3. I攜帶有EHV-IBamHI-HindIII目標片段，它用于構建質粒pXuBaxA。 H Δ gM-GFP的DNA與質粒pXuBaxA共轉染，得到H Δ gM_w (圖D)。限制性位點BamHl_B，Hindlll-H,Sphl-S, Hincll-Hc, Apal-A, Pstl-P圖2 :不含外源序列gM缺失的EHV-1病毒(HAgM-w)的Southern印跡將RacH 毒株，ΗΛ gM-GFP，以及 ΗΛ gM_w 的 DNA 用 BamHl, Hindlll，或 Pstl 裂解， 然后用GFP-特異性探針(GFP)或pBH3. I的EHV-IBamHI-HindIII片段進行分析(pBH3. I)。 使用CSro借助化學發光檢測DNA雜交體。分子量標記蛋白的分子量大小(Biolabs)在左側空白處以kbp大小給出。在箭頭所指處，特異性雜交體幾乎是不可見的。圖3 :不含外源序列的gM缺失的EHV-4病毒的構建(E4 Δ gM_w)本圖中，描述了 EHV-4NS80567株的BamHl圖譜。在放大圖中，BamHl-e片段包括gM和鄰近的ORFs (A)。圖B描述了質粒構建體和引物位點。質粒pgM4GFP+用于構建 E4 Δ gM-GFP,即 GFP 是陽性且 gM 是陰性的 EHV-4 (B, C)。將 E4 Λ gM-GFP 與包含 3. 109bp 大小EHV-4序列、包含gM-ORF的質粒pgM4R(B)進行DNA重組，可獲得E4RgM，即gM修復的(gM-r印aired) EHV-4⑷。或者將E4 Δ gM-GFP與質粒pgM4w⑶進行DNA重組，可獲得 E4 Δ gM-w，即GFP和gM都是陰性的E本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種蛋白gM缺失的馬皰疹病毒(EHV)，其特征在于所述EHV不含異源成分。

【技術特征摘要】
2002.07.19 DE 10233064.61.一種蛋白gM缺失的馬皰疹病毒(EHV)，其特征在于所述EHV不含異源成分。2.編碼權利要求I的EHV的核酸。3.包含權利要求I的EHV的疫苗制品。4.包含權利要求2的核酸的疫苗制品。5.權利要求I的EHV在制備預防和/或治療EHV相關疾病藥物中的應用。6.權利要求2的核酸在制備預防和/或治療EHV相關疾病藥物中的應用。7.一種預防和/或治療動物的方法，其特征在于對所述動物施用權利要求3或4的疫苗制品，且監測其治...

【專利技術屬性】
技術研發人員：安東尼紐鮑爾，克里斯蒂娜齊格勒，
申請(專利權)人：貝林格爾英格海姆維特梅迪卡有限公司，
類型：發明
國別省市：