用細胞系生產雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒與活疫苗制造技術

本發(fā)明專利技術提供了一種用細胞系生產雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒W93及其疫苗的方法，包括使用如Vero細胞系、BHK-21細胞系、PK-15細胞系、Marc145細胞系、ST細胞系、IBRS-2細胞系，在上述細胞系形成生長良好的細胞單層后，接種雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒，并使之吸附于上述細胞系；換用細胞維持液培養(yǎng)后，加入孵育劑對細胞進行孵育20-40分鐘，以進行雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒的增殖；當CPE達到75％以上時，收獲雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒。本發(fā)明專利技術用細胞系生產的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒疫苗的方法，可以實現(xiàn)以更安全、更有效地生產雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒及疫苗的目的。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及一種用細胞系生產的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒及雞嗜腎型傳染性支氣管炎活疫苗及其制備方法，屬于獸用疫苗領域。
技術介紹
雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是由雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的一種高度接觸性的病毒性傳染病。按病毒感染后出現(xiàn)的致病癥狀，即致病型，可以分為呼吸型、嗜腎型等。嗜腎型傳染性支氣管炎以腎臟病變?yōu)橹鳎€出現(xiàn)泌尿生殖系統(tǒng)病癥，伴有呼吸道癥狀，表現(xiàn)為腎臟蒼白腫大、腎小管和輸尿管擴張充滿尿酸鹽、排出白色稀糞等。目前防治本病多采用弱毒株W93的雞胚組織弱毒苗。雖然目前該苗安全性好，免疫效果理想，但雞胚苗的生產，除了勞動強度大、產量偏低外，還面臨著我國目前SPF雞胚緊缺，而采用一般雞胚制苗，不僅可能受雞胚中母源抗體干擾，使疫苗效價不穩(wěn)定，而且胚源性病原體極易隨著疫苗的研制、生產和發(fā)放使用造成某些疫病的人為傳播。
技術實現(xiàn)思路
有鑒于此，本專利技術的主要目的在于提供一種用細胞系生產的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒及雞嗜腎型傳染性支氣管炎活疫苗的方法及產品，以實現(xiàn)以更安全、更有效地生產雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒及疫苗的目的。技術方案本專利技術提供一種用細胞系生產雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒的方法，包括以下步驟I)將細胞系經消化傳代，以細胞生長液進行培養(yǎng)，形成生長良好的細胞單層；2)將雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒接種于上述細胞單層，進行雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒的吸附；3)將上述吸附病毒的細胞，換用細胞維持液培養(yǎng)，進行雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒的增殖；4)當CPE達到75%以上時，收獲雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒。優(yōu)選地，本專利技術所述細胞系為Vero細胞系、BHK-21細胞系、PK-15細胞系、Mar cl 45細胞系、ST細胞系、IBRS-2細胞系任意一種或幾種細胞系。優(yōu)選地，本專利技術所述細胞系為VeiX)細胞系。優(yōu)選地，本專利技術步驟2)中在接種病毒后，還包括加入孵育劑對細胞進行孵育20-40分鐘的過程。優(yōu)選地，本專利技術所述的孵育劑為D-氨基葡萄糖、干擾素或脂多糖。更優(yōu)選地，本專利技術所述的孵育劑為D-氨基葡萄糖。優(yōu)選地，本專利技術所述的孵育時間為30分鐘。優(yōu)選地，本專利技術所述的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒是雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒W93株。優(yōu)選地，本專利技術步驟2)中接種用的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒是在雞胚中傳代獲得的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒。由上可見，本專利技術可以獲得一種根據(jù)上述所述的方法制備的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒，所述病毒為使用細胞系生產的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒。本專利技術另一目的在于提供一種用細胞系生產雞嗜腎型傳染性支氣管炎活疫苗的·方法，包括使用上述方法獲得的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒，加入凍干保護劑，制備為雞嗜腎型傳染性支氣管炎活疫苗。由上可見，本專利技術可以獲得一種雞嗜腎型傳染性支氣管炎活疫苗，其特征在于，使用細胞系生產雞嗜腎型傳染性支氣管炎活疫苗。由上面的技術方案及本專利技術后續(xù)的具體實施方式可以看出，專利技術人意外地發(fā)現(xiàn)在雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒繁殖時對細胞進行孵育可以幫助雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒適應細胞系，使得用細胞系繁殖雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒成為了可能，從而實現(xiàn)了用細胞系生產雞嗜腎型傳染性支氣管炎疫苗。而在現(xiàn)有技術中，國內外無論使用Vero細胞、BHK-21細胞、PK-15細胞、Marcl45細胞、ST細胞、IBRS-2細胞等何種細胞或細胞系，或者使用同步培養(yǎng)、帶毒傳代等方法，都沒有實現(xiàn)雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒在細胞系(細胞)中獲得有效的增殖，并達到利用細胞系生產雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒或疫苗的程度。其次，專利技術人還發(fā)現(xiàn)在傳染性支氣管炎病毒接種細胞前可先在雞胚上進行傳代，可以幫助傳染性支氣管炎病毒更容易適應于細胞系，促進病毒在細胞系的增殖并加快產生細胞病變的速度及提高細胞生產傳染性支氣管炎病毒的滴度和質量。具體實施例方式本專利技術實施例中使用了常見的商業(yè)化的容易培養(yǎng)的細胞系如Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)、BHK-21細胞(幼倉鼠腎傳代細胞)、PK-15細胞(豬腎細胞)、Marcl45細胞(上皮樣細胞，來源于猴腎細胞)、ST細胞(豬睪丸細胞)、IBRS-2細胞(豬腎細胞)等細胞或細胞系生產雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒及疫苗。本專利技術實施例中接種用的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒優(yōu)選使用雞胚傳代適應的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒，或優(yōu)選使用細胞系生產獲得的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒；但是使用雞胚傳代適應的或細胞系生產的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒用于接種，其目的僅為了提高接種用的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒的效價，并使得接種用的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒更適應在細胞中生長，以及使雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒在細胞上能更快的出現(xiàn)細胞病變，獲得的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒的滴度更高、雞嗜腎型傳染性支氣管炎疫苗的效力更佳。因此，本專利技術的接種用雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒并不限于使用經雞胚傳代適應的雞嗜腎型傳染性支氣管炎以及經細胞系培養(yǎng)的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒，其他來源的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒如組織來源的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒液也可以用于接種細胞系生產雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒及疫苗。本專利技術實施例使用細胞系生產雞嗜腎型傳染性支氣管炎的疫苗為凍干活疫苗，還可以利用本專利技術實施例的方法獲得的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒，加入滅活劑，滅活后加入獸藥學上可接受的疫苗佐劑，獲得雞嗜腎型傳染性支氣管炎滅活疫苗。本專利技術的細胞培養(yǎng)液中血清為牛血清，優(yōu)選胎牛血清,其他的動物性血清如兔血清、羊血清等均可以作為細胞培養(yǎng)液。為使本專利技術更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本專利技術。應理解，這些實施例僅用于說明本專利技術而不用于限制本專利技術的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。實施例I Veix)細胞生產雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒及雞嗜腎型傳染性支氣管炎活疫苗本實施例中，選擇非洲綠猴腎細胞系VeiO細胞(購自中國科學院上海生命科學研 究院細胞資源中心)作為生產雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒與雞傳染性支氣管炎活疫苗的細胞系，雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒W93株毒種為購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。所用細胞生長培養(yǎng)液的配方是94% v/v DMEM(Invitrogen公司生產)液,6% v/v胎牛血清(PAA公司生產)，pH值調整為 . 2 ;所用細胞維持液的配方是99% v/v DMEM(Invitrogen公司生產)液，1% v/v胎牛血清(PAA公司生產)，pH值調整為7. 2。以下為使用Vero細胞生產雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒與疫苗的具體步驟I.生產用雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒種的制備首先可先將雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒W93株用無菌pH7. 2磷酸鹽緩沖液按體積比I : 100倍稀釋后，經尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每胚O. 1ml，置37°C繼續(xù)孵育，棄去24h前死胚，36h后取出所有胚放入4°C冰箱過夜，收集尿囊液，用SPF雞胚連續(xù)傳10代，無菌收集尿囊液并以3000rpm高速4°C離心50min取上清液即為所需的雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒(對雞胚毒力為108· 7EID50/0. 1ml)，備本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用細胞系生產雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)將細胞系經消化傳代，以細胞生長液進行培養(yǎng)，形成生長良好的細胞單層；2)將雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒接種于上述細胞單層，進行雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒的吸附；3)將上述吸附病毒的細胞，換用細胞維持液培養(yǎng)，進行雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒的增殖；4)當CPE達到75％以上時，收獲雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒。

【技術特征摘要】
1.一種用細胞系生產雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將細胞系經消化傳代，以細胞生長液進行培養(yǎng)，形成生長良好的細胞單層； 2)將雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒接種于上述細胞單層，進行雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒的吸附； 3)將上述吸附病毒的細胞，換用細胞維持液培養(yǎng)，進行雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒的增殖； 4)當CPE達到75%以上時，收獲雞嗜腎型傳染性支氣管炎病毒。2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于，所述細胞系為VeiO細胞系、BHK-21細胞系、PK-15細胞系、Marcl45細胞系、ST細胞系、IBRS-2細胞系任意一種或幾種細胞系。3.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2)中在接種病毒后，還包括加入孵育劑對細胞進行孵育20-40分鐘的過程。4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的孵育劑為D-氨基葡...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：張許科，孫進忠，
申請(專利權)人：普萊柯生物工程股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：