用細胞系生產兔瘟疫苗的方法及其制品技術

本發明專利技術提供了一種使用常見易培養的細胞系如RK13、ST、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等細胞系生產RHD病毒及疫苗的方法。該方法包括以下步驟：接種兔瘟病毒并進行吸附后，加入孵育劑進行細胞的孵育，并用細胞維持液培養細胞，獲得生產用兔瘟病毒種子；接種兔瘟病毒毒種吸附后，加入孵育劑進行細胞的孵育，重新加入細胞維持液培養細胞，獲得制苗用兔瘟病毒；加入滅活劑，滅活后加入獸藥學上可接受的疫苗佐劑制備為成品兔瘟疫苗。該方法使用培養病毒的細胞系是成熟的商業化的細胞系，具有生產工藝簡單穩定、易操作，病毒含量高，批間差異小，質量易控，可顯著提高疫苗產量和質量。利用本發明專利技術生產的兔瘟疫苗安全性好、免疫力高，對兔瘟強毒攻擊具有完全的免疫保護作用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種用細胞系生產兔瘟疫苗的方法及其制品，屬于獸用疫苗領域。
技術介紹
兔病毒性出血癥(rabbit heamorrhagic disease, RHD)是1984年由我國首次發現并報道的新病毒病。由于其發病急、傳播快、發病率和死亡率都相當高，所以又俗稱“兔瘟”，是兔的一種以全身性出血和多發性血管內凝血為主要癥狀的急性、烈性、病毒性傳染病。目前，國內各省(市)均有流行。意大利、德國、法國、前捷克斯洛伐克、前蘇聯、西班牙、墨西哥、朝鮮和日本等國家也有發生。給全世界養兔業造成了巨大的經濟損失，國際獸醫局將該病列為B類傳染病，我國農業部96號令頒布為二類疫病。RHD出現比較突然且流行速 度極快，現有研究結果表明世界范圍內的所有RHDV分離株均為同一血清型，無論是遺傳特性還是抗原性都很穩定。目前用兔病毒性出血癥組織滅活疫苗免疫是預防該病的主要措施，疫苗的制備過程中必須以RHDV感染致死的兔內臟組織為原料。如中國專利CN88108859. 5公開了一種用病兔肝組織培養RHD病毒及生產兔瘟疫苗的方法，但該方法疫苗的制備過程中必須以RHDV感染致死的兔內臟組織為原料，而用于制備組織滅活疫苗的非免疫兔的供應量卻很不穩定，造成傳統的組織滅活疫苗的成本不斷增加，另外組織滅活疫苗存在散播強毒的潛在危險、批間差異大、產量不高等種種缺點。近年來，隨著兔產品等行業的興起以及其他動物疫苗等對家兔的需求的增加，市場對兔病毒性出血癥疫苗的需求量增加了許多，但是用于制備組織滅活疫苗的非免疫兔的供應量卻很不穩定，造成傳統的組織滅活疫苗的成本不斷增加，加之組織滅活疫苗存在散播強毒的潛在危險、批間差異大、產量不高等種種缺點，組織滅活疫苗的廣泛應用受到一定的限制。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術的目的在于克服現有技術存在的不足之處，提供一種用細胞系生產兔瘟疫苗的方法，特別是使用常見易培養的細胞系如RK13、ST、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等細胞系生產RHD病毒及疫苗的方法。該方法使用培養病毒的細胞系是成熟的商業化的細胞系，具有生產工藝簡單穩定、易操作，病毒含量高，批間差異小，質量易控，可顯著提高疫苗產量和質量。利用本專利技術生產的兔瘟疫苗安全性好、免疫力高，對兔瘟強毒攻擊具有完全的免疫保護作用。本專利技術的主要目的在于提供一種用細胞系生產兔瘟病毒的方法，包括以下步驟I)細胞的培養將細胞系經消化傳代，以細胞培養液進行培養，形成生長良好的細胞單層；2)病毒接種與吸附將兔瘟病毒接種于上述生長良好的細胞單層，進行病毒吸附；3)細胞的孵育換用細胞維持液培養后，加入孵育劑進行細胞的孵育；4)病毒的繁殖將上述孵育劑洗去，重新加入細胞維持液培養細胞系以繁殖兔瘟病毒;5)病毒的收獲收獲含有兔瘟病毒的培養液。優選地，本專利技術步驟2)中用于接種的兔瘟病毒為使用細胞系生產的兔瘟病毒。優選地，本專利技術所述的細胞為RK13細胞、ST細胞、VeroE6細胞、BHK-21細胞、PK-15細胞、IBRS-2細胞的任意一種或幾種。優選地，本專利技術所述的細胞系為RK13細胞。 優選地，本專利技術所述的孵育劑為D-氨基葡萄糖、干擾素或脂多糖。優選地，本專利技術所述的孵育時間為20-40分鐘；更優選地，孵育時間為30分鐘。優選地，本專利技術所述的細胞生長液為含血清的培養液，其中血清含量為1% -7%v/v ;更優選地，所述細胞生長液的血清含量為5% _6%，最優地，血清含量為6%。優選地，本專利技術所述的細胞維持液為無血清的培養液。本專利技術的另一主要目的在于提供如上述的方法制備的兔瘟病毒，其中，使用細胞系生產兔瘟病毒。本專利技術的另一主要目的在于提供一種用細胞系生產兔瘟疫苗的方法使用上述方法生產的兔瘟病毒，加入滅活劑，滅活后加入獸藥學上可接受的疫苗佐劑制備為兔瘟疫苗。本專利技術的另一主要目的還在于提供一種用細胞系生產的兔瘟疫苗，其中，使用了細胞系用于生產兔瘟疫苗。由上可以看出，專利技術人意外地發現在兔瘟病毒繁殖時對細胞系進行細胞孵育可以幫助兔瘟病毒適應細胞系，特別是通過在生產用毒種和制苗用病毒中均使用孵育劑進行孵育，使得用細胞系繁殖兔瘟病毒成為了可能，從而實現了用細胞系生產兔瘟疫苗。而在現有技術中，國內外無論使用RK13、ST、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等何種細胞系，或者使用同步培養、帶毒傳代、兔血清培養等方法，都沒有實現兔瘟病毒在細胞系中獲得有效的增殖,并達到利用細胞系生產兔瘟疫苗的目的。其次，專利技術人還發現在細胞的培養中使用低血清的細胞培養液，而在細胞的孵育和病毒的增殖中換用無血清的細胞維持液，可以幫助兔瘟病毒適應細胞系，促進病毒在細胞系的增殖，而在細胞生長階段又不影響良好細胞單層的形成。基于以上發現，本專利技術獲得了一種使用細胞系生產的兔瘟病毒及兔瘟疫苗，本專利技術的兔瘟疫苗至少有以下優點I)用細胞系替代兔體組織制備兔瘟疫苗，可解決外源病原污染的問題，通過原材料和培養條件的嚴格控制，保證生產出來的疫苗純粹，確保疫苗的安全性；2)采用本專利技術的兔瘟病毒及兔瘟疫苗的生產方法，病毒的培養原料是較為廉價的細胞系，使用也比兔體組織更加方便；3)采用本專利技術培養的兔瘟細胞毒液病毒含量高，用高滴度的抗原制造的兔瘟疫苗可以大大提高疫苗的免疫力，經免疫攻毒試驗結果顯示，對兔瘟強毒攻擊可100%保護；4)用細胞系生產兔瘟疫苗各批間質量差異小，具有生產工藝穩定、易操作、產量大、成本低等特點，具備工業化大生產的可行性和可放大性，具有很好的經濟效益和應用前旦O5)用細胞系代替兔體組織制備兔瘟疫苗，可解決組織苗在注射過程中易引起兔體精神不振、減食、注射部位過敏紅腫等不良反應。具體實施例方式本專利技術實施例中使用了常見的商業化的容易培養的細胞系如RK13、ST、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等細胞系生產RHD病毒及疫苗，其他的哺乳動物細胞，也可以應用本專利技術的方法生產RHD病毒及疫苗。本專利技術實施例中接種用的兔瘟病毒優選使用細胞系生產獲得的兔瘟病毒；但是使 用細胞系生產的接種用的兔瘟病毒的目的僅為了提高接種用的兔瘟病毒的效價和使得接種用的兔瘟病毒更適應在細胞中生長，獲得疫苗的效力更佳。因此，本專利技術的接種用兔瘟病毒并不限于使用經細胞系培養的兔瘟病毒，其他來源的兔瘟病毒如組織來源的兔瘟病毒液也可以用于接種細胞系生產兔瘟病毒及疫苗。本專利技術的細胞培養液中血清為胎牛血清，其他的動物性血清如兔血清、羊血清等均可以作為細胞生長液，只要其血清含量比常規使用情況下的血清含量低，使得兔瘟病毒更容易適應在細胞中的生長，而又不影響細胞本身形成良好單層細胞即可。本專利技術的疫苗為滅活疫苗，也可以使兔瘟病毒進行弱化后，使用弱化病毒制備活疫苗，或使用基因工程方法獲得轉基因病毒，使用本專利技術的在動物細胞中培養方法制備滅活疫苗或活疫苗。為使本專利技術更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本專利技術。應理解，這些實施例僅用于說明本專利技術而不用于限制本專利技術的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規實驗方法進行。實施例1RK13細胞生產兔瘟病毒與兔瘟疫苗I. RK13細胞生產兔瘟病毒與兔瘟疫苗的方法本實施例中，選擇兔腎細胞系RK13(購自中國獸醫藥品監察所)作為生產兔瘟病毒與兔瘟疫苗的細胞系，兔瘟病毒AV33毒種購自中本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用細胞系生產兔瘟病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)細胞的培養：將細胞系經消化傳代，以細胞培養液進行培養，形成生長良好的細胞單層；2)病毒接種與吸附：將兔瘟病毒接種于上述生長良好的細胞單層，進行病毒吸附；3)細胞的孵育：換用細胞維持液培養后，加入孵育劑進行細胞的孵育；4)病毒的繁殖：將上述孵育劑洗去，重新加入細胞維持液培養細胞系以繁殖兔瘟病毒；5)病毒的收獲：收獲含有兔瘟病毒的培養液。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張許科，孫進忠，白朝勇，
申請(專利權)人：普萊柯生物工程股份有限公司，
類型：發明
國別省市：