本發(fā)明專利技術(shù)提供豬偽狂犬病毒、疫苗組合物及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)的豬偽狂犬病毒PRV-JS株，其微生物保藏號是：CGMCCNO.6604。本發(fā)明專利技術(shù)還提供疫苗組合物，包括滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株和獸藥學(xué)上可接受的佐劑。該疫苗組合物還包括獸藥學(xué)上可接受載體。本發(fā)明專利技術(shù)從各地豬場分離的豬偽狂犬病流行毒株中篩選出豬偽狂犬病毒PRV-JS株，該毒株具有良好的免疫原性，可作為滅活疫苗生產(chǎn)毒株及檢驗(yàn)用毒種。本發(fā)明專利技術(shù)提供的疫苗組合物免疫后，豬產(chǎn)生的抗體水平較高，持續(xù)期長。采用本發(fā)明專利技術(shù)制備的疫苗組合物可用于預(yù)防豬偽狂犬病毒引起的母豬繁殖障礙、種豬不育癥及其它豬的偽狂犬病。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物
，具體涉及一株豬偽狂犬病毒、疫苗組合物及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus)屬于抱疫病毒科中抱疫病毒亞科豬抱疫病毒I型，能引起急性傳染的豬偽狂犬病(Aujeszky' s disease)。豬偽狂犬病在世界范圍內(nèi)大流行，對全球的養(yǎng)豬業(yè)危害極大，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬發(fā)生偽狂犬病以后，其臨床癥狀取決于感染豬的年齡、病毒株的毒力、感染的劑量和途徑。成年豬一般呈隱性感染，懷孕母豬可導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、木乃伊和種豬不育等綜合癥候群。15日齡以內(nèi)的仔豬發(fā)病死亡率可達(dá)100%，斷奶仔豬發(fā)病率40%，死亡率20%左右；對成年肥豬可引起生長停滯，增重緩慢等。目前本病被認(rèn)為是威脅養(yǎng)豬生產(chǎn)和引起死亡的主要疾病之一。·疫苗接種是有效防制豬偽狂犬病最經(jīng)濟(jì)、有效的方法。我國目前預(yù)防豬偽狂犬病的疫苗主要Bartha -K61株和BUK株等基因缺失弱毒活疫苗，弱毒疫苗免疫效果好沿用多年，至今在偽狂犬病的防制中仍起著重要作用。但是在實(shí)際生產(chǎn)中該病并沒有得到很好的控制，其中存在的問題引起疫苗研究者的重視。首先，弱毒疫苗可引起潛伏感染，并有散毒的危險(xiǎn)，部分接種豬盡管血清中存在中和抗體，但排毒期仍可持續(xù)數(shù)年。其次，弱毒疫苗株在動(dòng)物體內(nèi)可能會(huì)與野毒或不同的基因缺失疫苗株之間發(fā)生基因重組從而變成強(qiáng)毒株成為新的傳染源。再次，未經(jīng)充分致弱或過度致弱的疫苗株不僅不能誘導(dǎo)足夠的免疫保護(hù)反應(yīng)，反而可能引起疾病及免疫抑制。對仔豬來說，其體內(nèi)的母源抗體一定程度上影響了弱毒活疫苗的免疫效果。所以，豬偽狂犬滅活疫苗比弱毒疫苗能更有效地預(yù)防和控制偽狂犬病。但是，現(xiàn)有技術(shù)中存在的豬偽狂犬滅活疫苗的免疫效果、抗體持續(xù)期都不理想。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一株豬偽狂犬病毒PRV-JS株，該毒株對目前流行的豬偽狂犬病毒有很好的免疫原性。本專利技術(shù)的另一目的是提供一種疫苗組合物，該疫苗組合物免疫豬抗體水平較高，持續(xù)期長。本專利技術(shù)還提供豬偽狂犬病毒PRV-JS株在制備預(yù)防由豬偽狂犬病毒所致疾病藥物中的應(yīng)用。本專利技術(shù)的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 豬偽狂犬病毒PRV-JS株，其微生物保藏號是=CGMCC NO. 6604。豬偽狂犬病毒PRV-JS株的保藏信息如下 生物材料(株)=PRV-JS分類命名豬皰疹病毒I型 拉丁文學(xué)名Pseudorabies virus 保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所 保藏日期2012年9月24日 保藏編號CGMCC NO. 6604. 一種疫苗組合物，包括滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株和獸藥學(xué)上可接受的佐劑。該疫苗組合物還包括獸藥學(xué)上可接受載體。所述疫苗組合物的制備方法，包括如下步驟 制備水相將吐溫-80與滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株病毒液按體積比4 96混合均勻，得到水相； 制備油相將司本-80與注射用白油按照體積比為6 94混勻，得到油相； 乳化將油相和水相按照體積比為3 1混合并乳化，獲得所述疫苗組合物。 本專利技術(shù)還提供豬偽狂犬病毒PRV-JS株在制備預(yù)防由豬偽狂犬病毒所致疾病藥物中的應(yīng)用。所述疾病為豬偽狂犬病毒引起的仔豬神經(jīng)癥狀、母豬繁殖障礙及種豬不育癥。該疫苗組合物還包括獸藥學(xué)上可接受載體。本專利技術(shù)從各地豬場分離的豬偽狂犬病流行毒株中篩選出豬偽狂犬病毒PRV-JS株，該毒株具有良好的免疫原性，可作為滅活疫苗生產(chǎn)毒株及檢驗(yàn)用毒種。本專利技術(shù)提供的疫苗組合物免疫后，豬產(chǎn)生的抗體水平較高，持續(xù)期長。采用本專利技術(shù)制備的疫苗組合物可用于預(yù)防豬偽狂犬病毒引起的母豬繁殖障礙、種豬不育癥及其它豬的偽狂犬病。附圖說明圖I接種了含毒材料的BHK21細(xì)胞的照片。圖2正常BHK21細(xì)胞的照片。圖3斷奶仔豬攻毒后的體溫變化。圖4是發(fā)病豬各組織PCR鑒定的電泳圖，其中泳道I-陰性對照，泳道2-腦，泳道3-淋巴，泳道4-肺，泳道5-腎，泳道6-脾，泳道7-2000 DNA Maker。圖5仔豬免疫豬偽狂犬病滅活疫苗后的ELISA抗體水平。圖6顯示攻毒后仔豬的體溫變化。圖7豬偽狂犬病滅活疫苗免疫后備母豬ELISA抗體消長規(guī)律。具體實(shí)施例方式實(shí)施例I豬偽狂犬病毒的獲得和特性測定 I.病毒分離 采集我國江蘇南京地區(qū)某一養(yǎng)豬場發(fā)病仔豬的脾、肺、腎、淋巴組織作為含毒材料。先將含毒材料無菌操作置于乳缽中，然后加入滅菌生理鹽水5ml，反復(fù)磨細(xì)；在每毫升處理過的含毒材料中加入青霉素200U和鏈霉素200U，混勻，將其放入-20 1冰箱內(nèi)反復(fù)凍融3次，每次快凍快融以使病毒能從破碎的細(xì)胞中釋放出來；12000 r/min離心lOmin，取上清接種至BHK21細(xì)胞(購買自ATCC，即美國模式培養(yǎng)物集存庫)培養(yǎng)。培養(yǎng)2天后，與正常BHK21細(xì)胞(圖2)相比，含毒材料接種的BHK21細(xì)胞出現(xiàn)明顯拉網(wǎng)樣病變(圖I)。將培養(yǎng)物凍融2次后，獲得病毒液。2.病毒鑒定 提取本實(shí)施例標(biāo)題I中所獲病毒液中的DNA，具體步驟如下取病毒液400 μ L，加入12. 5 μ L蛋白酶K和50 μ L、濃度為10%的SDS溶液，混勻，56°C作用30min ;依次加入200 μ L氯仿和200 μ L苯酚，劇烈振蕩15s，室溫放置5min ；4°C，12000轉(zhuǎn)離心IOmin ;取上清，加入等體積的氯仿混勻，室溫放置5min ；4°C, 12000轉(zhuǎn)離心IOmin ;取上清加入2倍體積的無水乙醇和I / 10體積、濃度為3M的乙酸鈉溶液，_20°C放置30min ；4°C, 12000轉(zhuǎn)離心IOmin ；棄上清，加入75%的乙醇1000 μ L洗滌；4°C，7500轉(zhuǎn)離心5min ;棄上清，干燥IOmin ;加入15 μ L雙蒸水溶解沉淀并作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)一對gE蛋白基因區(qū)域引物進(jìn)行PCR鑒定，上游引物PRV-F (SEQ ID NO: I):CCCTGGACGCGAACGGCACGATG ;下游引物 PRV-R (SEQ ID NO:2): GGGTGGCACGCGGTCTCGAAGCA。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系(50ul):模板 5 μ L, GC Buffer 25 μ L, Mg2+ 3 μ L, dNTP2 μ L, PRV-F I μ L, PRV-R I μ L, Taq DNA 聚合酶 O. 5 μ L，H2O 12. 5 μ L。 PCR 反應(yīng)程序94°C 預(yù)變性 5min ;進(jìn)入循環(huán)94°C 60s，68°C 60s, 72°C 60s, 35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。將PCR擴(kuò)增出的目的片段進(jìn)行測序，結(jié)果顯示片段為850bp，具體序列如SEQ ID NO: 3所示。在NCBI進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)測序的片段與豬偽狂犬病毒基因相似率達(dá)到98%以上(結(jié)果見表1)，證明此毒株為豬偽狂犬病毒。表I目的片段序列分析比對序列號 [SII相似__￥_AY683136.I SuidherpesvirusIstrainSHglycoproteingl(US7)andglycoproteingE(US8)genes, partialcds99%AF171937.I Suidher本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
豬偽狂犬病毒PRV?JS株，其微生物保藏號是：CGMCC?NO.6604。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：唐波，張道華，張雪花，侯繼波，
申請(專利權(quán))人：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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