舞毒蛾核型多角體病毒的生產(chǎn)工藝制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種舞毒蛾病毒的生產(chǎn)方法，其中對(duì)舞毒蛾病毒復(fù)制最佳幼蟲(chóng)齡期、接毒濃度、接毒時(shí)間等進(jìn)行了改進(jìn)。通過(guò)這些改進(jìn)完善了舞毒蛾核型多角體病毒工廠化生產(chǎn)流程與方法，擴(kuò)大了舞毒蛾病毒產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本，為野外大面積推廣應(yīng)用舞毒蛾核型多角體病毒防治舞毒蛾奠定基礎(chǔ)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種舞毒蛾病毒的生產(chǎn)方法，其用于生產(chǎn)舞毒蛾病毒殺蟲(chóng)劑，屬于林木害蟲(chóng)——舞毒蛾生物防治領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
舞毒蛾(Lymantria dispar L.),又名秋千毛蟲(chóng)、蘋(píng)果毒蛾、柿毛蟲(chóng),隸屬于鱗翅目 Lepidoptera,毒蛾科Lymantriidae,毒蛾屬Lymantria,是世界性食葉害蟲(chóng)，具有分布廣、 食性雜、危害重、幼蟲(chóng)隨風(fēng)遷移等特點(diǎn)。由于舞毒蛾對(duì)農(nóng)林業(yè)的危害嚴(yán)重，近百年來(lái)，人們采用了多種方法對(duì)舞毒蛾進(jìn)行防治。化學(xué)農(nóng)藥防治是應(yīng)用最早也是迄今為止應(yīng)用最為廣泛的防治手段。因其具有經(jīng)濟(jì)、有效、方法簡(jiǎn)便、不受地形限制等特點(diǎn)，當(dāng)森林蟲(chóng)害發(fā)生時(shí)，能在短期內(nèi)取得滿意的防治效果，減少經(jīng)濟(jì)損失。但大量采用化學(xué)制劑防治，產(chǎn)生了嚴(yán)重的一 3R”問(wèn)題，即抗藥性 (Resistance)、再娼獗(Resurgence)和殘留(Residue)。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高和環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，使用和開(kāi)發(fā)高效、低毒、無(wú)公害的農(nóng)藥已成為發(fā)展的必然趨勢(shì)。昆蟲(chóng)病毒不僅具有寄主專一性、防治效果好、不污染環(huán)境、對(duì)其它生物安全、不使害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，而且病毒還能在環(huán)境中積累，通過(guò)外界因子的刺激或誘發(fā)等多種途徑在害蟲(chóng)種群中形成流行病而長(zhǎng)期控制蟲(chóng)口密度，在害蟲(chóng)的可持續(xù)控制中發(fā)揮重要的作用。在舞毒蛾防治中，核型多角體病毒(NPV)是最常用的一種。利用舞毒蛾核型多角體病毒(LdNPV)防治舞毒蛾已有幾十年的歷史。國(guó)外對(duì)LdNPV的應(yīng)用研究較早，60年代初就開(kāi)始利用舞毒蛾核型多角體病毒進(jìn)行林間防治，并取得了較為理想的效果。實(shí)驗(yàn)證明，舞毒蛾核型多角體病毒是影響舞毒蛾種群動(dòng)態(tài)的主要因子之一，常引起舞毒蛾種群數(shù)量的急劇下降，是有效防治舞毒蛾、降低其危害的有效方法。應(yīng)用舞毒蛾核型多角體病毒(LdNPV) 防治舞毒蛾在世界各地均取得了良好效果，特別是在各種化學(xué)合成殺蟲(chóng)劑嚴(yán)重污染環(huán)境以及害蟲(chóng)對(duì)化學(xué)合成殺蟲(chóng)劑抗性日益增強(qiáng)的情況下，應(yīng)用舞毒蛾核型多角體病毒防治舞毒蛾顯得尤為重要和迫切。上述試驗(yàn)證明，LdNPV對(duì)舞毒蛾不但有良好的防治效果，且對(duì)哺乳動(dòng)物無(wú)不良影響，值得推廣使用。目前，舞毒蛾核型多角體病毒以在舞毒蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)復(fù)制最為經(jīng)濟(jì)，且舞毒蛾人工飼養(yǎng)技術(shù)已成功解決，但利用人工飼料飼養(yǎng)的舞毒蛾接毒齡期、接毒濃度、接毒時(shí)間對(duì)舞毒蛾生長(zhǎng)、發(fā)育、存活以及病毒復(fù)制量是否存在影響還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本專利技術(shù)對(duì)舞毒蛾病毒復(fù)制最佳幼蟲(chóng)齡期、接毒濃度、接毒時(shí)間等進(jìn)行了試驗(yàn)篩選。通過(guò)這些試驗(yàn)完善了舞毒蛾核型多角體病毒工廠化生產(chǎn)流程與方法，擴(kuò)大了舞毒蛾病毒產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本， 為野外大面積推廣應(yīng)用舞毒蛾核型多角體病毒防治舞毒蛾奠定基礎(chǔ)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)涉及一種舞毒蛾病毒擴(kuò)增的生產(chǎn)方法，其特征在于，將濃度為I.OX 106PIB/ml的舞毒蛾病毒施予飼料上，用帶有病毒的飼料來(lái)飼養(yǎng)4齡舞毒蛾的幼蟲(chóng)使其感染，10天后收集感毒蟲(chóng)或死亡蟲(chóng)，粉碎、過(guò)濾，將濾液離心后收集沉淀。根據(jù)本專利技術(shù)，所述舞毒蛾病毒優(yōu)選舞毒蛾核型多角體病毒。進(jìn)一步優(yōu)選的，本專利技術(shù)涉及一種舞毒蛾病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟I)舞毒蛾病毒的擴(kuò)增將配制好的病毒液(濃度為I. OX 106PIB/ml)均勻施予飼料(例如人工飼料)表面， 晾干(以人工飼料表面無(wú)水滴為準(zhǔn))后，讓4齡幼蟲(chóng)取食感染，擴(kuò)增室溫度優(yōu)選控制在25°C。2)感毒蟲(chóng)的收集及病毒提取健康蟲(chóng)接毒10天后，收集感毒蟲(chóng)或死亡蟲(chóng)，放入容器中，優(yōu)選將其放入_18°C的冰箱中保存，必須保證及時(shí)收集，避免蟲(chóng)體破損造成病毒液流失。將收集的感毒蟲(chóng)或死亡蟲(chóng)的尸體加無(wú)菌水稀釋(例如2 3倍)，粉碎(優(yōu)選在高速組織搗碎機(jī)上，做間斷勻漿2 3min)，用紗布過(guò)濾(優(yōu)選三層)，然后再用篩子過(guò)濾(優(yōu)選80 目)，濾液加水稀釋(例如2 3倍)，再離心(例如使用16000r/min離心機(jī))，棄上清液，得沉淀。將提取的多角體沉淀加適量蒸餾水稀釋，利用血球計(jì)數(shù)器在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。多角體含量不得低于2. 5 X IOkiPIBAiI。本專利技術(shù)進(jìn)一步涉及一種舞毒蛾病毒殺蟲(chóng)劑的制備方法，將上述擴(kuò)增得到的舞毒蛾病毒用水稀釋，加入熒光素鈉、防腐劑、乳化劑、甘油，攪拌得到懸浮液劑。在上述制備過(guò)程中，優(yōu)選在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，所有器皿、分裝盛具均優(yōu)選消毒滅菌，所述水優(yōu)選使用無(wú)菌水。進(jìn)一步優(yōu)選的，本專利技術(shù)涉及一種舞毒蛾病毒殺蟲(chóng)劑的制備方法將已測(cè)數(shù)的多角體沉淀物加水稀釋至2. δΧΚΓΡΙΒ/πιΙ，稱取螢光素鈉，再加少量無(wú)菌水，充分研磨溶解后， 加入多角體懸液再攪勻；將防腐劑溶于無(wú)菌水然后加入前液中攪勻，加入乳化劑攪勻；最后加入甘油，用電動(dòng)機(jī)攪拌(例如20min)。分裝，封口，貼標(biāo)簽。在配制過(guò)程中，應(yīng)在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。飼毒齡期、飼毒濃度以及飼毒時(shí)間均是影響LdNPV室內(nèi)增殖的重要因子。其中飼毒齡期低于4齡時(shí)，幼蟲(chóng)體重增加速率緩慢，蟲(chóng)尸重也越小,從而影響最終的病毒獲得量。但齡期若太高(5齡)，會(huì)有絕大部分個(gè)體發(fā)育至蛹期，最終也影響病毒的產(chǎn)量。舞毒蛾飼毒以4齡幼蟲(chóng)為最佳。同飼毒齡期一樣，飼毒濃度對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)體重、蟲(chóng)尸重以及含毒量也存在一定影響。飼毒濃度高于1.0X106PIB/ml時(shí)，會(huì)抑制幼蟲(chóng)的取食，促進(jìn)幼蟲(chóng)死亡的速度，從而影響體重增長(zhǎng)，蟲(chóng)尸重也越低。但飼毒濃度若低于該濃度時(shí)，最終死亡幼蟲(chóng)體重同此濃度無(wú)顯著差異，但死亡時(shí)間會(huì)增加4 - 8d，從而增加一次喂飼次數(shù)，提高人工飼養(yǎng)成本。飼毒濃度以I.0X106PIB/ml 為最佳。飼毒時(shí)間優(yōu)選10天，此時(shí)收集的飼毒蟲(chóng)體重最高，體內(nèi)濃度含量也最高。根據(jù)本專利技術(shù)，所述飼料可以為人工飼料，或者為本專利技術(shù)人于2011年11月19日提交的，申請(qǐng)?zhí)枮?01110318830. 5，專利技術(shù)名稱為“舞毒蛾核型多角體病毒殺蟲(chóng)劑的生產(chǎn)工藝” 的在先申請(qǐng)中提及的飼料或人工飼料，其全文引入本文作為參考。根據(jù)本專利技術(shù)，所述人工飼料可以為干酪素35g、韋氏鹽10g、蔗糖12g、果糖23g、麥胚60g、氯化膽堿lg、對(duì)輕I. 5g、瓊脂25g、金霉素O. 3g、抗壞血酸4g、4M KOH 5ml、38%甲醒O.5ml、55%亞麻酸4. 3ml、混合維生素IOml (煙酸100g、泛酸I丐100g、核黃素50g、鹽酸硫胺素25g、鹽酸吡哆醇25g、葉酸25g、生物素2g、B120. 2g)、水860ml ;或者飼料干酪素40g、蔗糖30g、韋氏鹽10g、山梨酸2g、麥胚100g、瓊脂16g、對(duì)羥 lg、混合維生素IOg (抗壞血酸280g、氯化膽堿55g、葉酸250ml、肌醇20g、煙酸lg、卩比卩多辛 230mg、膽固醇 50g、B121. 5g)、水 800ml。根據(jù)本專利技術(shù)，所述人工飼料包括韋氏鹽4-15重量份、麥胚80-180重量份、干酪素 30-90重量份、鹿糖5-15重量份、抗壞血酸4-15重量份、氯化膽堿0. 3_6重量份、肌醇0. 3-6 重量份、膽固醇0.5-6重量份。優(yōu)選地，進(jìn)一步包括瓊脂8-25重量份、水適量。更優(yōu)選地， 所述飼料還包括山梨酸0. 3-6重量份。更優(yōu)選的，本專利技術(shù)的人工飼料包括韋氏鹽6-10重量份、麥胚100-140重量份、干酪素35-70重量份、蔗糖8-13重量份、抗壞血酸6-10重量份、氯化膽堿0. 5-4重量份、肌醇0.5-4重量份、膽本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種舞毒蛾病毒擴(kuò)增的生產(chǎn)方法，將濃度為1.0×106PIB/ml的舞毒蛾病毒施予飼料上，用上述帶有病毒的飼料來(lái)飼養(yǎng)4齡舞毒蛾的幼蟲(chóng)使其感染，10天后收集感毒蟲(chóng)或死亡蟲(chóng)，粉碎、過(guò)濾，將濾液離心后收集沉淀。

【技術(shù)特征摘要】
1.ー種舞毒蛾病毒擴(kuò)增的生產(chǎn)方法，將濃度為I. OX 106PIB/ml的舞毒蛾病毒施予飼料上，用上述帶有病毒的飼料來(lái)飼養(yǎng)4齡舞毒蛾的幼蟲(chóng)使其感染，10天后收集感毒蟲(chóng)或死亡蟲(chóng)，粉碎、過(guò)濾，將濾液離心后收集沉淀。2.如權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)方法，包括如下步驟 1)、舞毒蛾病毒的擴(kuò)增 將配制好的病毒液(濃度為I. OX 106PIB/ml)均勻施予飼料(例如人工飼料)表面，晾干(以人工飼料表面無(wú)水滴為準(zhǔn))后，讓4齡幼蟲(chóng)取食感染，擴(kuò)增室溫度優(yōu)選控制在25°C ； 2)、感毒蟲(chóng)的收集及病毒提取 健康蟲(chóng)接毒10天后，收集感毒蟲(chóng)或死亡蟲(chóng)，放入容器中，優(yōu)選將其放入_18°C的冰箱中保存， 將收集的病死蟲(chóng)尸加無(wú)菌水稀釋(例如2 3倍)，粉碎(優(yōu)選在高速組織搗碎機(jī)上，做間斷勻漿2 3min)，用紗布過(guò)濾(優(yōu)選三層)，然后再用篩子過(guò)濾(優(yōu)選80目)，濾液加水稀釋(例如2 3倍),再離心(例如使用16000r/min離心機(jī)),...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：梁洪柱，陳倩，田會(huì)鵬，梁曉梅，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京市西山試驗(yàn)林場(chǎng)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：