本發明專利技術公開了一種對蛋白酶抑制劑耐藥的HIV毒株。本發明專利技術提供了一種重組HIV病毒，是將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶自N末端第48位氨基酸殘基的密碼子由甘氨酸的密碼子突變為纈氨酸的密碼子、第54位氨基酸殘基的密碼子由異亮氨酸的密碼子突變為纈氨酸的密碼子、第82位氨基酸殘基的密碼子由纈氨酸的密碼子突變為丙氨酸的密碼子，得到的重組HIV病毒。本發明專利技術對于抗HIV藥物的篩選具有重大價值，進而對艾滋病的治療具有深遠影響。本發明專利技術構建的耐藥毒株對克力芝（LPV/r）具有良好的耐藥性，可以體外模擬病人由于使用此蛋白酶抑制劑所產生的耐藥性，如果新藥對此毒株有良好的抗病毒效果，那么此藥才有上市的必要。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種對蛋白酶抑制劑耐藥的HIV毒株。
技術介紹
人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)是引起人類獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)的病原體，自1981年美國首次診斷出艾滋病以來，艾滋病在全球范圍內迅速傳播，2010年底全球約3400萬人攜帶HIV，我國截止2011年底有78萬HIV感染者和艾滋病病人。HIV基因組由兩條相同的正鏈RNA組成，每條RNA長約9. 2-9. 8kb，包括如下9個基因(I) gag基因(編碼約500個氨基酸組成的聚合前體蛋白，經蛋白酶水解形成P17，P24、 P7、P6等核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破壞)；(2) pol基因(編碼聚合酶前體蛋白，經切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉錄酶、核糖核酸酶H，均為病毒增殖所必需)；(3) env基因(編碼約 863個氨基酸的前體蛋白并糖基化成gpl60，并切割形成gpl20和gp41) ； (4) tat基因(編碼蛋白可與LTR結合，以增加病毒所有基因轉錄率，也能在轉錄后促進病毒mRNA的翻譯)；(5)rev基因(產物是一種順式激活因子，能對env和gag中順式作用抑制序去抑制作用，增強gag和env基因的表達，以合成相應的病毒結構蛋白);(6)nef基因(編碼蛋白P27對HIV 基因的表達有負調控作用);(7)vif基因(可以介導機體細胞內的天然抗病毒蛋白AP0BEC3G 的降解，影響游離HIV感染性、病毒體的產生和體內傳播)；(8) vpu基因(為HIV-1所特有， 可以介導機體細胞內的天然抗病毒蛋白Tetherin的降解，為HIV的有效復制所必需)；(9) vpr基因(編碼蛋白是一種弱的轉錄激活物，具有致凋亡和細胞周期改變功能，在病毒體內繁殖周期中起一定作用)。 1996年高效抗反轉錄病毒聯合治療(HAART)的出現和應用成為艾滋病(AIDS)抗病毒治療史上具有里程碑意義的重大事件。臨床觀察表明，抗病毒治療對減輕病情、提高病人生活質量、延長生命具有很好的作用。目前已經應用于臨床的藥物包括核苷類逆轉錄酶抑制劑、非核苷類逆轉錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、融合抑制劑、整合酶抑制劑和CCR5受體拮抗劑六類。蛋白酶抑制劑包括沙奎那韋(saquinavir)、卻地那韋(indinavir)、利托那韋(ritonavir)、奈非那韋(nelfinavir)、安普那韋(amprenavir)、福司安普那(fosamprenavir)、洛匹那韋(lopinavir)、安扎那韋(atazanavir)、替派那韋 (tipranavir)和達如那韋(darunavir)共十種。利托那韋(ritonavir) —般作為藥代動力學增強劑，與其他藥物配伍，提高血藥濃度，減少單一突變對藥物活性的影響?？肆χ?洛匹那韋/利托那韋；LPV/r)是由蛋白酶抑制劑洛匹那韋和利托那韋組成的復方制劑，是目前最有效的臨床治療藥物之一。美國衛生與公共服務部(DHHS)于2011年10月發布了最新成人及青少年HIV/ AIDS抗病毒治療指南，其中對于孕婦的HAART首選方案、成人及青少年多個備選抗病毒方案和一些可以接受的抗病毒治療方案中均包括蛋白酶抑制劑?？梢娫诿绹呐R床治療觀察中，蛋白酶抑制劑是一種非常有效的抗病毒治療藥物。我國從2003年開始在全國范圍內逐步實施免費的艾滋病抗病毒治療，現免費提供的抗艾滋病藥物有七種，包括核苷類逆轉錄酶抑制劑、非核苷類逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑三類。克力芝(LPV/r)是其中唯一的免費蛋白酶抑制劑。我國2012年發布的第三版《國家免費艾滋病抗病毒藥物治療手冊》對于妊娠、分娩、哺乳期的感染女性推薦的治療方案也包括克力芝(LPV/r)。在我國對艾滋病感染者提供的免費治療包括一線和二線藥物治療方案。其中一線藥物治療方案只包括兩種核苷類逆轉錄酶抑制劑和一種非核苷類逆轉錄酶抑制劑，是我國剛開始提供免費抗艾滋病病毒治療時采用 的方案。然而，隨著其應用范圍的不斷擴大和應用時間的不斷延長，耐藥性問題已經日益凸顯，部分地區治療病人中HIV耐藥性發生率已經超過了 60%，成為制約HIV免費治療的一個主要瓶頸。HIV是一種能夠產生高度變異的病毒，它復制更新很快，缺乏逆轉錄酶的校對功能，致使它能很快產生繼發性耐藥毒株，甚至當治療失敗后，病人已經對多種藥物產生耐藥性，或者因HIV的原發性耐藥，病人對初始方案就不敏感。所以，現今的臨床治療會先檢測病人體內病毒的耐藥性，根據病人情況為其制定治療方案。在一線藥物無法有效抑制病毒復制時，需要更換使用二線藥物。二線藥物一般包括兩種核苷類逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑。截止2012年7月31日，全國正在接受抗病毒治療的人數為146635例，其中服用二線藥物的有22003例，全國兒童正在服用二線藥物的人數為223例，毋庸置疑，隨著耐藥性問題的日益嚴重，蛋白酶抑制劑的應用將越來越廣泛。由于合成工藝比較困難，中國蛋白酶抑制劑的仿制落后于核苷類、非核苷類逆轉錄酶抑制劑，我國面臨必須填補蛋白酶抑制劑生產空白的現狀，為HIV感染者提供更多的抗病毒治療選擇。根據新藥研發的有關規定，新型抗HIV藥物上市前必須評價其耐藥性，即使用蛋白酶抑制劑耐藥的HIV毒株檢測其抗病毒效果，再進行臨床觀察。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種對蛋白酶抑制劑耐藥的HIV毒株。本專利技術提供了一種重組HIV病毒，是將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶自N 末端第48位氨基酸殘基的密碼子由甘氨酸(G)的密碼子突變為纈氨酸(V)的密碼子、第54 位氨基酸殘基的密碼子由異亮氨酸(I)的密碼子突變為纈氨酸(V)的密碼子、第82位氨基酸殘基的密碼子由纈氨酸(V)的密碼子突變為丙氨酸(A)的密碼子，得到的重組HIV病毒。所述蛋白酶可為序列表的序列3所不的蛋白質。所述野生型HIV病毒可為野生型的HIV-1B亞型病毒。所述“第48位氨基酸殘基的密碼子由甘氨酸(G)的密碼子突變為纈氨酸(V)的密碼子”的實現方法如下將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶的基因的開放閱讀框自 5’末端第143位核苷酸由g突變為t。所述“第54位氨基酸殘基的密碼子由異亮氨酸(I)的密碼子突變為纈氨酸(V)的密碼子”的實現方法如下將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶的基因的開放閱讀框自5’末端第160位核苷酸由a突變為g。所述“第82位氨基酸殘基的密碼子由纈氨酸(V)的密碼子突變為丙氨酸(A)的密碼子”的實現方法如下將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶的基因的開放閱讀框自5’末端第245位核苷酸由t突變為C。以上任一所述編碼蛋白酶的基因可為序列表的序列2所示的DNA分子。所述重組HIV病毒是將重組質粒導入離體的哺乳動物細胞并培養哺乳動物細胞得到的；所述重組質粒為將特異DNA分子插入表達載體的多克隆位點得到的重組質粒；所述特異DNA分子為將野生型HIV病毒的基因組DNA中編碼蛋白酶自N末端第48位氨基酸殘基的密碼子由甘氨酸(G)的密碼子突變為纈氨酸(V)的密碼子、第54位氨基酸殘基的密碼子由異亮氨酸(I)的密碼子突變為纈氨酸(V)的密碼子、第82位氨基酸殘基的密碼子由纈氨酸(V)本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種重組HIV病毒，是將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶自N末端第48位氨基酸殘基的密碼子由甘氨酸的密碼子突變為纈氨酸的密碼子、第54位氨基酸殘基的密碼子由異亮氨酸的密碼子突變為纈氨酸的密碼子、第82位氨基酸殘基的密碼子由纈氨酸的密碼子突變為丙氨酸的密碼子，得到的重組HIV病毒。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李林，李敬云，李天一，李韓平，劉永健，鮑作義，劉思揚，莊道民，王曉林，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所，
類型：發明
國別省市：
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