預防西尼羅河病毒的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E及疫苗與應用制造技術

本發明專利技術屬于動物病毒學和動物基因工程技術領域，具體涉及一種表達西尼羅河病毒prM蛋白和E蛋白的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E的構建、疫苗制備及應用。本發明專利技術得到一種表達西尼羅河病毒prM蛋白和E蛋白的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E，該重組假型桿狀病毒保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏號為CCTCC?NO：V201130。本發明專利技術還公開了重組假型桿狀病毒的制備及在制備預防西尼羅河病毒疫苗中的應用。本發明專利技術為預防西尼羅河病毒提供了新型基因工程疫苗。

【技術實現步驟摘要】
預防西尼羅河病毒的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E及疫苗與應用
本專利技術屬于動物病毒學和動物基因工程
具體涉及一種表達西尼羅河病毒prM/E蛋白的重組假型桿狀病毒株的構建、用該重組病毒制備的疫苗及其在預防西尼羅河病毒中的應用。
技術介紹
西尼羅河熱(West Nile Fever,簡稱WNF)是由西尼羅河病毒(West Nile Virus, WNV)感染引起的人和多種動物共患的急性傳染病。1937年，WNV首次在兩尼羅河地區一個發燒的烏干達婦女血液中分離出來，并命名為西尼羅河病毒。1999年美國出現疫情，并于隨后幾年迅速擴散至全美大部分地區，導致兩萬多人感染，數百人死亡(Nash D.F等，The outbreak of West Nile virus infection in the New York City area in 1999. N. Engl. J. Med. 2001,344 :1807-1814)，一度引發世界性恐慌。目前，該病還沒有有效的疫苗進行免疫預防。迄今為止，中國尚未發現WNV感染的臨床病例，但是中國的氣候、地里環境復雜，蚊蟲種類繁多，具備傳播條件，隨著國際交流的日益頻繁，WNV傳入中國境內的可能性非常大。 因此，開展該病的疫苗研究，對于WNV的預防具有重要的意義。WNV是不分節段的單股正鏈RNA病毒，是一種B群蟲媒病毒，病毒核殼外面包裹著脂質雙層膜，膜內鑲嵌有前膜蛋白(premembrine protein, PrM)和包膜蛋白(envelope protein, E)。E蛋白是WNV重要的結構蛋白，屬糖蛋白，具有血細胞凝集素活性，并介導病毒與宿主細的粘附和膜融合，是重要的毒力因子；而且具有很強的免疫原性，可誘發機體產生病毒中和抗體，逃避宿主免疫監督系統的攻擊。而PrM蛋白對于E蛋白的正確折疊和切割具有重要作用(Beasley D.W 等，Identification of neutralizing epitopes within structural domain III of the West Nile virus envelope protein. J. Virol. 2002, 76:13097-13100.)。因此，prM/E基因作為WNV的主要免疫原性基因，是研制WNV新型疫苗的主要候選基因。NaohiiO Ohtaki選用CHO細胞系穩定的持續性共表達WNV的M前體蛋白(prM)和E蛋白形成VLPs (virus-like particles)，這種大量表達的VLPs蛋白作為免疫原能保護小鼠抵抗 WNV(Naohiro Ohtaki 等，Immunogenicity and efficacy of two types of West Nile virus-like particles different in size and maturation as a second-generation vaccine candidate. Vaccine. 2010，28 :6588-6596)。Arroyo J 等利用黃熱病毒YFV-17D作為載體將WNV的prM/E蛋白閱讀框取代黃熱病毒自身的蛋白，構建嵌合疫苗(Arroyo J等，Chimer1-vax-West Nile virus live attenuated vaccine preclinical evaluation of safety, immunogenicity and efficacy. J Virol. 2004. 78 497-507.)。這種嵌合疫苗產生了很好的免疫效果，但是這種重組的病毒有可能產生未知的病原特性，不利于實時監控。徐敏等應用慢病毒載體包裝表達WNV prM/E基因的假病毒，并通過轉導哺乳動物細胞證明該基因可以在轉導細胞中穩定表達，從而為基于慢病毒載體的 WNV新型疫苗開發奠定基礎(徐敏等，慢病毒載體介導的西尼羅河病毒prME蛋白的表達，中國獸醫科學，2010，40 :778-782)。桿狀病毒載體是目前應用十分廣泛的病毒載體之一，它被廣泛的應用于基因治療、基因功能研究、疫苗開發等領域。桿狀病毒是昆蟲病毒中最大的一個科，其宿主范圍主要集中在昆蟲綱鱗翅目。目前，用于外源基因表達的昆蟲桿狀病毒僅限于核多角體病毒屬，其中苜猜銀紋蛾多粒包埋體核多角型病毒(Autographa californica mulltiple nucleopolyhedrosis virus,簡稱AcMNPV)和草地貪夜蛾細胞系統是國際上普遍采用的桿狀病毒表達載體系統研究模型。長期以來研究者一直認為桿狀病毒具有嚴格的宿主特異性，僅限用于介導外源基因在其受納昆蟲細胞內表達。而研究認為，在非受納昆蟲細胞中， 這種宿主特異性的產生并不是因為桿狀病毒不能進入細胞，而是因為其基因不能在細胞內復制和表達(Frederick M 等，Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. PNAS. 1996. 93 :2348-2352)。1993年Luckow等成功地將桿狀病毒系統改造成 Bac-to-Bac 系統(Luckow 等，Current Opinion in Biotechnology, 1993,4, 564-572),主要用于在昆蟲細胞中大量表達外源基因。1995年，Hofmann等首次報道了將由巨細胞病毒極早期啟動子(cytomegalovirus immediate early promoter, CMV-1E)驅動的螢光素酶基因重組至AcMNPV基因組，并用此重組AcMNPV感染幾種不同的哺乳動物細胞，結果表明此重組AcMNPV能感染原代人肝細胞且高效地表達了報告基因，其介導的報告基因的表達效率高于用磷酸韓沉淀法和脂質體轉染法(Hofmann C等，Efficient gene transfer into human hepatocytes by baculovirus vectors. PNAS. 1995. 2 :10099-10103) 進一步的實驗發現新鮮的血清能阻止病毒介導的基因投送至肝臟細胞系，而熱滅活后的血清卻無此現象。用缺乏各種補體成分的血清進行實驗，也沒有阻止病毒的侵入(Hofmann 等，Baculovirus-mediated gene transfer in the presence of human serum or blood facilitated by inhibition of the complement system. Gene Therapy. 1998. 5 531-536)。水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatatis Virus，VSV)膜融合蛋白 G 蛋白是一種穿膜糖蛋白，它能利用其膜融合的活性介導病毒基因組從哺乳動物細胞內吞體中逃逸(Barsoum 等，Efficient transduction of mammalian cells by a recombinant baculovirus having the vesicular st本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種表達西尼羅河病毒prM蛋白和E蛋白的重組假型桿狀病毒Bac?G?prM/E，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC?NO：V201130。

【技術特征摘要】
1.一種表達西尼羅河病毒prM蛋白和E蛋白的重組假型桿狀病毒Bac-G-prM/E，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC NO :V201130。2.一種預防西尼...

【專利技術屬性】
技術研發人員：曹勝波，朱碧波，徐敏，葉靜，楊曉紅，陳龍，陳煥春，錢平，肖少波，
申請(專利權)人：華中農業大學，
類型：發明
國別省市：