本發明專利技術涉及桿狀病毒HearNPV?LEF-9蛋白抗體的制備。通過設計引物克隆lef-9基因；原核表達構建重組質粒pET-28a-lef-9；將構建的重組質粒pET-28a-lef-9轉化大腸桿菌BL21，構建表達LEF-9蛋白的重組菌株；對LEF-9蛋白進行誘導表達及純化。通過本發明專利技術的方法，實現了原核表達桿狀病毒HearNPV?LEF-9蛋白，可以用于后期制備其多克隆抗體，為進一步研究LEF-9蛋白的功能特性奠定了基礎。為人們對桿狀病毒RNA聚合酶有一個更全面和深入的了解，為進一步利用其構建高效的體外轉錄系統奠定了基礎。
【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術涉及桿狀病毒HearNPV?LEF-9蛋白抗體的制備。通過設計引物克隆lef-9基因；原核表達構建重組質粒pET-28a-lef-9；將構建的重組質粒pET-28a-lef-9轉化大腸桿菌BL21，構建表達LEF-9蛋白的重組菌株；對LEF-9蛋白進行誘導表達及純化。通過本專利技術的方法，實現了原核表達桿狀病毒HearNPV?LEF-9蛋白，可以用于后期制備其多克隆抗體，為進一步研究LEF-9蛋白的功能特性奠定了基礎。為人們對桿狀病毒RNA聚合酶有一個更全面和深入的了解，為進一步利用其構建高效的體外轉錄系統奠定了基礎。【專利說明】桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白的制備
本專利技術涉及一種蛋白的制備方法，特別涉及。
技術介紹
桿狀病毒是昆蟲的特異性病原體，是已知昆蟲病毒中最大的類群，也是發現最早、研究最多且具有非常重要實用價值的昆蟲病毒，桿狀病毒作為高效的真核基因表達載體系統、有效的病毒殺蟲劑和潛在的基因治療載體系統受到學術界的廣泛關注。桿狀病毒基因組編碼多種基因，根據基因表達的時序性，桿狀病毒的基因分為早期基因和晚期基因兩大類。因為目前大多數證據表明，病毒基因的時序表達是通過時序之前的一組病毒基因的表達產物，直接或間接地反式激活其時序之后的一組病毒基因的轉錄，因而調節主要發生在轉錄水平上。因此作為轉錄病毒晚期基因的病毒RNA聚合酶就成為調節病毒早晚期基因轉錄表達的關鍵因素。桿狀病毒RNA聚合酶由病毒誘導及編碼，當病毒基因組開始復制后，早期基因停止轉錄，病毒RNA聚合酶特異性識別含有保守序列TAAG的晚期基因啟動子并開始晚期基因的轉錄。研究表明病毒RNA聚合酶僅由病毒編碼的4個保守基因lef-4、lef_8、lef-9和P47組成，這四種蛋白構成的復合體可以在體外轉錄病毒晚期基因。雖然早在上世紀80年代科學家便發現了該酶的存在，但迄今為止我們對它的了解還非常有限?，F已知在其四個基本組成成分中P47定位在細胞核內，是晚期基因轉錄的必需基因，LEF-4起mRNA加帽及錨定啟動子的作用，LEF-8與聚合酶特異性識別晚期啟動子有關，且推測與LEF-9共同構成了 RNA聚合酶的催化位點。LEF-9是病毒RNA聚合酶中第二大蛋白，如果能夠解析HearNPV LEF-9亞基在病毒RNA聚合酶中的功能，將使人們對桿狀病毒RNA聚合酶有一個更全面和深入的了解，為進一步利用其構建聞效的真核基因表達載體系統、制備有效的病毒殺蟲劑和開發基因治療載體系統奠定基礎。為了研究該蛋白，制備其多克隆抗體是一個必須的前期基礎，而制備多克隆抗體的前提是要大量獲得該蛋白。
技術實現思路
本專利技術的目的是原核表達桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白，用于后期制備其多克隆抗體，以便對LEF-9蛋白的功能特性進行研究，使人們對桿狀病毒RNA聚合酶有一個更全面和深入的了解。本專利技術采用的技術方案是:桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白的制備，步驟如下: I)lef-9 基因的克隆:設計引物 28a55F:5’ -gcgggatccatgtcgaaaacacgtggctcg—3，和 28a55R:5，-gcgaagctttcatattaaaaacatgtctagcaaatg-3>,以 HearNPV 基因組 DNA 為模版擴增lef-9完整閱讀框，PCR反應條件為:94°C預變性5min ；94°C 30s, 59°C 30s, 68°C30s為一個循環，進行30個循環；最后68°C延伸7min，得到lef-9基因PCR產物；2)原核表達載體的構建:用凝膠回收試劑盒回收基因PCR產物，用"i/7dIII和Bamm雙酶切，同時用相同兩酶雙酶切原核表達載體pET-28a，將酶切片段和載體通過T4DNA連接酶連接，構建重組質粒pET-28a-lef-9 ； 3)重組表達菌株的構建:將構建的重組質粒pET-28a-lef-9轉化大腸桿菌BL21，構建表達LEF-9蛋白的重組菌株； 4)LEF-9蛋白的誘導表達及純化:將pET-28a-lef-9陽性單菌落接種于5mLKana抗性LB培養基中，37°C振蕩培養過夜，取過夜培養物按1%體積接種于2管250mL新鮮LB培養基中，37°C振蕩培養3h至OD6tltlnm為0.6后，加IPTG至終濃度為0.4mmol/L,培養5h，離心收集菌體； 5)LEF-9蛋白的純化:將步驟4中收集的菌體重懸于5ml裂解緩沖液中，_70°C反復凍融3次，超聲波破碎，條件為功率200-300 W，超聲3s停5s，總計20min，至菌懸液變澄清后12000 r/min離心15 min，重復3次，去除不溶性細胞碎片，獲得含有LEF-9蛋白的上清液，將該上清液通過Ni2+親和柱，再用5倍柱體積的250 mM咪唑濃度洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫下來的蛋白并測A280，當有蛋白峰時開始收集樣品，直至A280又恢復至基準線。收集的蛋白通過SDS-PAGE進行檢測。本專利技術的有益效果是:通過本專利技術的方法，實現了原核表達桿狀病毒HearNPVLEF-9蛋白，可以用于后期制備其多克隆抗體，為進一步研究LEF-9蛋白的功能特性奠定了基礎。為人們對桿狀病毒RNA聚合酶有一個更全面和深入的了解，為進一步利用其構建高效的體外轉錄系統奠定了基礎?！緦＠綀D】【附圖說明】圖1是重組質粒pET-28a-lef-9的構建圖。圖2A是lef-9基因擴增結果的SDS-PAGE電泳圖。其中，M:分子標準；1 'lef-9基因擴增片段。圖2B 是 pET-28a-lef_9 鑒定的 SDS-PAGE 電泳圖。其中，M:分子標準；1:pET-28a-lef-9酶切結果。圖3是純化LEF-9蛋白檢測圖。圖中，M:分子標準；I:純化的LEF-9蛋白。【具體實施方式】實施例1 桿狀病毒HearNPV LEF-9蛋白的制備 具體操作方法如下: 1.lef-9基因的克隆 設計引物 28a55F:5’ -gcgggatccatgtcgaaaacacgtggctcg—3，(下劃線表示位點)和 28a55R: 5，-gcgaagctttcatattaaaaacatgtctagcaaatg-3，(下劃線表不/ZifldIII 位點)，以HearNPV基因組DNA為模版擴增lef-9完整閱讀框，PCR反應條件為:94°C預變性5min ；94°C 30s, 59°C 30s, 68°C 30s為一個循環，進行30個循環；最后68°C延伸7min，得lef-9基因PCR產物。反應產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果顯示獲得1578bp片段(圖2A)。2.原核表達表達載體的構建用凝膠回收試劑盒回收純化lef-9基因PCR產物，用#i/7dIII和雙酶切，同時用相同兩酶雙酶切原核表達載體pET-28a，將酶切片段和載體通過T4 DNA連接酶連接構建重組質粒pET-28a-lef_9 (圖1 )，轉化大腸桿菌DH5 α，卡那霉素抗性篩選陽性菌株，提取質粒，酶切鑒定陽性克隆子(圖2Β)，經上海生工測序，基因序列結果為序列表SEQ ID N0.1所示，測序鑒定克隆子無突變。3.重組表達菌株的構建 將構建成功的重組質粒pET-28a-lef-9轉化大腸本文檔來自技高網...
【技術保護點】
桿狀病毒HearNPV?LEF?9蛋白的制備，其特征在于步驟如下：1)?lef?9?基因的克隆：設計引物28a55F：5’?gcgggatccatgtcgaaaacacgtggctcg?3’和28a55R：5’?gcgaagctttcatattaaaaacatgtctagcaaatg?3’，以HearNPV基因組DNA為模版擴增lef?9完整閱讀框，PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃?30s，59℃?30s，68℃?30s為一個循環，進行30個循環；最后68℃延伸7min，得到lef?9基因PCR產物；2）原核表達載體的構建：用凝膠回收試劑盒回收lef?9基因PCR產物，用HindIII和BamHI雙酶切，同時用相同兩酶雙酶切原核表達載體pET?28a，將酶切片段和載體通過T4?DNA連接酶連接，構建重組質粒pET?28a?lef?9；3）重組表達菌株的構建：將構建的重組質粒pET?28a?lef?9轉化大腸桿菌BL21，構建表達LEF?9蛋白的重組菌株；4）LEF?9蛋白的誘導表達：將pET?28a?lef?9陽性單菌落接種于5mL?Kana抗性LB培養基中，37℃振蕩培養過夜，取過夜培養物按1%體積接種于2管250mL新鮮LB培養基中，37℃振蕩培養3h至OD600nm為0.6后，加IPTG至終濃度為0.4mmol/L，培養5h，離心收集菌體；5）LEF?9蛋白的純化：將步驟4中收集的菌體重懸于5ml裂解緩沖液中，??70℃反復凍融3次,超聲波破碎，條件為功率200?300?W，超聲3s停5s，總計20min，至菌懸液變澄清后12000?r/min離心15?min，重復3次，去除不溶性細胞碎片，獲得含有LEF?9蛋白的上清液，將該上清液通過Ni2+親和柱，再用5倍柱體積的250?mM咪唑濃度洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫下來的蛋白并測A280，當有蛋白峰時開始收集樣品，直至A280又恢復至基準線。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭方亮，朱春玉，佘曉雙，
申請(專利權)人：遼寧大學，
類型：發明
國別省市：
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