菌株及其應(yīng)用，以及疫苗及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及菌株及其應(yīng)用，以及疫苗及其制備方法。本發(fā)明專利技術(shù)提供一種水貂細(xì)小病毒性腸炎、出血性肺炎二聯(lián)滅活疫苗及其制備工藝，該疫苗的(菌)毒種為我國流行的水貂細(xì)小病毒毒株MEVB株和水貂銅綠假單胞菌G型DL15株、B型JL08株、C型WD01株、I型WF05株、F型DL03株，作為抗原的細(xì)小病毒性腸炎和銅綠假單胞菌菌株培養(yǎng)后分別用甲醛滅活后按比例混合，按比例加入氫氧化鋁膠配制而成，該疫苗免疫期為6個月，免疫保護率80％以上，可同時用于預(yù)防水貂細(xì)小病毒性腸炎和水貂出血性肺炎的，減少了養(yǎng)殖戶的免疫工作量和水貂應(yīng)激反應(yīng)，市場應(yīng)用前景較好。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物
，特別涉及菌株及其應(yīng)用，以及疫苗及其制備方法。
技術(shù)介紹
毛皮動物主要指產(chǎn)品為制裘原料的動物。隨著經(jīng)濟的發(fā)展、人們生活水平的提高和需求的不斷增長，中國毛皮業(yè)呈現(xiàn)出強勁的發(fā)展趨勢。我國毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)主要集中在山東、河北、遼寧和黑龍江等地，養(yǎng)殖的品種主要有水貂、貉、狐、獺兔，年產(chǎn)水貂皮600萬張、狐貍皮200萬張，其中狐貍皮占世界總產(chǎn)量的35％，水貂皮占世界總產(chǎn)量的12％。經(jīng)過多年的發(fā)展和積累，毛皮動物養(yǎng)殖已成為一項優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，我國已成為世界上最大的毛皮產(chǎn)品生產(chǎn)國和出口國，它的發(fā)展不僅為國家賺取了大量外匯，還直接帶動了農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，促進了農(nóng)民增收，局部地區(qū)甚至已成為區(qū)域經(jīng)濟的支柱性產(chǎn)業(yè)，對推動“三農(nóng)”經(jīng)濟發(fā)展起到了重要的作用。水貂出血性肺炎是由銅綠假單胞菌引起水貂的一種急性傳染病，多發(fā)生于秋季溫暖潮濕，以咳嗽、呼吸困難、吐血、鼻出血為臨床特癥、以肺大面積出血、肺肝樣變、肺水腫為主要病變特征，發(fā)病率為20％-50％，死亡率為100％。病貂發(fā)病急,死亡快,常呈地方性暴發(fā)性流行。近年來由于水貂養(yǎng)殖規(guī)模和集約化程度明顯提高，水貂出血性肺炎的發(fā)病率顯著上升，該病危害程度逐年加深，已成為危害我國水貂養(yǎng)殖的主要傳染病之一。鑒于該病的發(fā)病特點及該菌易產(chǎn)生耐藥性問題，用藥物治療該病往往很困難，滅活疫苗是預(yù)防該病的最有效方法，將水貂中流行的血清型的菌株滅活后制備成多價滅活疫苗，可有效預(yù)防同類血清型菌株引起的該病，“水貂銅綠假單胞菌分離株的生物學(xué)特性比較分析和血清型調(diào)查”(白雪，柴秀麗，閆喜軍，高晗，張海玲，趙建軍，張蕾，邵西群，羅國良，王長鳳)，“水貂出血性肺炎二價滅活疫苗及其制備方法”(專利號：ZL201010203879.1，閆喜軍、白雪、柴秀麗、羅國良、趙建軍、張海玲、邵西群、張蕾、高晗,)公開了我國引起水貂出血性肺炎的銅綠假單胞菌的主要血清型為G型和B型，并利用這2種血清型菌株DL15(國家菌種保藏號CGMCCNO.3811)和JL08(國家菌種保藏號CGMCCNO.3812)研制出了可用于預(yù)防水貂出血性肺炎的二價滅活疫苗，2011年該產(chǎn)品獲得了農(nóng)業(yè)部的臨床試驗批件，并同時進行了臨床推廣應(yīng)用。2016年獲得了國家新獸藥證書(三類)。水貂病毒性腸炎是水貂腸炎細(xì)小病毒(Minkenteritisparvovirus,MEV)引起的以劇烈腹瀉為主要臨床特癥的急性烈性、高度接觸性傳染病，其死亡率高達80％以上，該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，在自然條件下，不同品種和不同年齡的貂均有感染性，但幼貂的感染性極強，隨著特種養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，病毒性腸炎已經(jīng)成為危害水貂養(yǎng)殖的三大疫病之一，給養(yǎng)貂業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，1947年由加拿大學(xué)者Schofield最早發(fā)現(xiàn)并報道了MEV引起的疾病。1981年姜廷秀等首先報道了我國發(fā)生水貂病毒性腸炎，此后該病逐漸蔓延全國,給養(yǎng)貂業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。我單位吳威等用單克隆抗體對我國分離的水貂腸炎細(xì)小病毒進行系統(tǒng)分型，確定我國水貂腸炎細(xì)小病毒主要由B型細(xì)小病毒引起，在此基礎(chǔ)上選育出毒力穩(wěn)定、免疫原性良好的病毒株MEVB株,并研制出水貂細(xì)小病毒滅活疫苗，2010年獲得了國家新獸藥證書(三類)，并迅速在市場上應(yīng)用。使該病得到較好的控制。目前國內(nèi)還未有水貂細(xì)小病毒性腸炎、水貂出血性肺炎的二聯(lián)疫苗，市場上也無該種二聯(lián)苗使用。而使用單苗需要對水貂進行多次免疫，免疫劑量大，免疫程序繁瑣，增加了人力、物力和財力成本，同時還易引起水貂的應(yīng)激反應(yīng)。本項目在研究成功水貂細(xì)小病毒性腸炎和水貂出血性肺炎的基礎(chǔ)上開發(fā)“一針防兩病”的水貂細(xì)小病毒性腸炎和出血性肺炎二聯(lián)滅活疫苗，技術(shù)上攻克了聯(lián)苗中的兩種成分細(xì)小病毒和銅綠假單胞菌的抗原成分互相干擾、疫苗含量配比及生產(chǎn)工藝的問題。本研究在水貂出血性肺炎二價滅活疫苗研制的基礎(chǔ)上，在疫苗株中新加入了近幾年出現(xiàn)的流行株I型、C型和F型，制備為水貂出血性肺炎五價滅活疫苗(G型、B型、I型、C型和F型)，能夠?qū)λ醭鲅苑窝仔碌难逍途甑牧餍衅鸬胶芎玫念A(yù)防作用，可解決國內(nèi)原有疫苗的對該病只能提供部分保護的問題，更為有效預(yù)防水貂出血性肺炎的發(fā)生。通過對二聯(lián)疫苗的研制及關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新，研制出一種高效、副作用小、市場推廣可行的二聯(lián)苗，解決了單苗免疫程序上的復(fù)雜問題，滿足行業(yè)和養(yǎng)殖戶的迫切需求，具有廣闊的市場應(yīng)用前景。現(xiàn)有技術(shù)是用轉(zhuǎn)瓶通氣的培養(yǎng)技術(shù)將這兩株銅綠假單胞菌用PYG培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)，37℃180r/m搖床培養(yǎng)12h后收菌，用細(xì)菌平板計數(shù)法測定兩株菌的菌量分別達到40×108CFU/ml，將G型菌株和B型菌株按2：1的比例混合；(1)用終濃度為0.15％的甲醛溶液對銅綠假單胞菌進行滅活，于37℃滅活24h，期間振搖2～3次；(2)將滅活后的菌液加20％比例的氫氧化鋁膠，混勻后即可得到水貂銅綠假單胞菌多價滅活疫苗。原有的培養(yǎng)基：PYG培養(yǎng)基成份：蛋白胨2％，葡萄糖1％，氯化鈉0.5％，酵母粉0.3％，用去離子水配制，配完調(diào)pH值7.2～7.4，116℃30min。但是使用轉(zhuǎn)瓶通氣培養(yǎng)菌體，接種比例為3％～4％，通氣培養(yǎng)12～15h，由于疫苗的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝落后，轉(zhuǎn)瓶數(shù)目較多接菌時易于污染，培養(yǎng)時間長，生產(chǎn)菌數(shù)少，在20～40億CFU/ml之間，只適用于疫苗研制前期的小批量生產(chǎn)。選用銅綠假單胞菌的當(dāng)前主要流行血清型G、B型和肺炎克雷伯菌K1型3種菌株制備成滅活疫苗。免疫了以10％滅活肺炎克雷伯菌為佐劑的疫苗，保護率為83％；免疫了以10％Al(OH)3佐劑的疫苗，保護率為71％；而作為空白對照組，僅注射了生理鹽水的第6組小鼠的存活率為33％。相對于傳統(tǒng)的Al(OH)3佐劑，肺炎克雷伯菌本身可以作為疫苗成分，保護機體免于該病原菌的感染，同時又兼有良好的免疫調(diào)節(jié)活性，加強了機體對銅綠假單胞菌的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生了更高的抗體水平和提供了更好的免疫保護，獸醫(yī)臨床具有一定的應(yīng)用價值。以上幾種研制的水貂出血性肺炎中使用的疫苗株血清型主要包含2種或3種，即G型，B型，或G型、C型、I型，根據(jù)本單位進行的水貂出血性肺炎流行病學(xué)調(diào)查，2010年至2015年的流行血清型新出現(xiàn)了F型、I型和C型，而由于各種流行血清型之間的交叉保護率低，大約為20％-30％。所以有必要加入所有可能的流行血清型。
技術(shù)實現(xiàn)思路
有鑒于此，本專利技術(shù)提供了菌株及其應(yīng)用，以及疫苗及其制備方法。該疫苗免疫期為6個月，免疫保護率80％以上，可同時用于預(yù)防水貂細(xì)小病毒性腸炎和水貂出血性肺炎的，減少了養(yǎng)殖戶的免疫工作量和水貂應(yīng)激反應(yīng)，市場應(yīng)用前景較好。為了實本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種銅綠假單胞菌株，其特征在于，其保藏編號為CGMCC?No.11988、CGMCC?No.11990和/或CGMCC?No.11989。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種銅綠假單胞菌株，其特征在于，其保藏編號為CGMCCNo.11988、CGMCCNo.11990
和/或CGMCCNo.11989。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌株在制備水貂出血性肺炎疫苗中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌株在制備水貂細(xì)小病毒性腸炎、出血性肺炎二
聯(lián)滅活疫苗中的應(yīng)用。
4.一種水貂出血性肺炎疫苗，其特征在于，由權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌株以及水
貂銅綠假單胞菌G型DL15株、B型JL08株制得。
5.一種水貂細(xì)小病毒性腸炎、出血性肺炎的二聯(lián)滅活疫苗，其特征在于，由權(quán)利要求1
所述的銅綠假單胞菌株以及水貂銅綠假單胞菌G型DL15株、B型JL08株和水貂細(xì)小病毒毒株
MEVB株制得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
步驟1：取權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌株以及水貂銅綠假單胞菌G型DL15株、B型
JL08株分別接種于培養(yǎng)基培養(yǎng)后混合、滅活后制得滅活后銅綠假單胞菌五價苗半成品菌
液；
步驟2：取水貂細(xì)小病毒毒株MEVB株接種細(xì)胞，收獲、滅活制得細(xì)小病毒半成品；
步驟3：取步驟1制得的滅活后銅綠假單胞菌五價苗半成品菌液與步驟2制得的細(xì)小病
毒半成品混合制得混合液；

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：閆喜軍，白雪，魯榮光，胡博，吳威，柴秀麗，趙建軍，張海玲，張蕾，劉昊，
申請(專利權(quán))人：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：吉林;22