成纖維細胞疫苗及其制備方法和用途技術

本發明專利技術屬于生物醫藥技術領域，具體涉及成纖維細胞疫苗及其制備方法和用途。本發明專利技術要解決的技術問題是為治療器官纖維化提供一種新選擇。本發明專利技術的技術方案是滅活的成纖維細胞疫苗，其主要活性成分為堿性成纖維生長因子(bFGF)激活的成纖維細胞。本發明專利技術還提供了所述成纖維細胞疫苗的制備方法，包括如下步驟：1)原代成纖維細胞的獲取；2)bFGF刺激成纖維細胞；3)輻照滅活，凍存。前述所有操作均在無菌條件下完成。本發明專利技術的成纖維細胞疫苗具有免疫活性強、臨床安全性高等優點，是一種優秀的針對器官纖維化的細胞疫苗。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物醫藥
，具體涉及成纖維細胞疫苗及其制備方法和用途。
技術介紹
雖然不同的器官纖維化的發生機制有差別，但具有很多共性。總的來說是以各種原因引起的實質細胞損傷為起點，實質細胞變性壞死，激活相應的巨噬細胞(前炎癥細胞)，釋放多種細胞因子和生長因子，后者激活靜息狀態的細胞外基質產生細胞，使之轉化為成纖維細胞合成大量的膠原等細胞外基質成分，同時細胞外基質降解減少，導致器官組織內大量細胞外基質沉積，引起器官纖維化。在纖維化過程中，成纖維細胞是最主要的細胞外基質產生細胞。(如肝星狀細胞、腎間質成纖維細胞、肺成纖維細胞、心臟成纖維細胞等都是相應器官纖維化的細胞外基質主要來源細胞)。正常是細胞外基質產生細胞處于靜息狀態，其代謝和功能不活躍。但在纖維化的情況下，成纖維細胞活化，表現為細胞形態發生改變，明顯增殖、分泌細胞因子、合成大量細胞外基質和產生蛋白降解酶等功能。活化是纖維化形成的關鍵步驟和核心環節。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)作為一種細胞絲裂原和促血管生長因子，在許多腫瘤的生長中及與異常新生血管相關的疾病，包括牛皮癬、黃斑變性等起重要的作用。在超過90％的上皮來源腫瘤中的成纖維細胞，被證明高表達bFGF。一般認為，晚期的實質器官纖維化是不可逆的，臨床的治療手段及治療效果有限。以肺纖維化為例，臨床多采用激素或免疫抑制劑的抗炎治療，但效果非常有限，副作用較大。阻斷纖維化過程中重要的活化的成纖維細胞的生長及增殖的細胞疫苗將給器官纖維化的治療帶來一個全新的治療方式，它側重于病情發生發展的根本，而不僅僅控制發病的癥狀，是一種極具發展潛力的治療方式。專利
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是為治療器官纖維化提供一種新選擇。本專利技術的技術方案是成纖維細胞疫苗，其主要活性成分為滅活的堿性成纖維生長因子激活的成纖維細胞。具體的，所述的疫苗中成纖維細胞的劑量為1～10×105個細胞。本專利技術還提供了所述成纖維細胞疫苗的制備方法，包括如下步驟：1)獲取原代成纖維細胞；2)在含有bFGF的培養基中刺激培養成纖維細胞；3)輻照滅活，保存。前述3個步驟的操作均在無菌條件下完成。所述保存可采用凍存的方式。其中，步驟1)的具體步驟如下：取小鼠背部及腹部的皮膚，PBS漂洗，Ⅰ型膠原酶消化，收集成纖維細胞。具體的，步驟1)的操作如下：切取小鼠背部及腹部的皮膚，置于含有100μg/ml慶大霉素和25μg/ml二性霉素B的PBS中，反復經過PBS漂洗后，剪棄脂肪和結締組織；將皮膚剪成1mm3左右的小塊，加入含有1mg/mlⅠ型膠原酶的DMEM中，37℃孵育2～3小時，800g離心3min收集成纖維細胞。其中，步驟2)中含人bFGF的培養基中bFGF的濃度為50～500ng/ml。其中，步驟2)的具體步驟如下：用含有15％胎牛血清的DMEM調定成纖維細胞密度為2～4×105/毫升，37℃、5％CO2、90％濕度條件下培養，當培養的成纖維細胞長成單層以1/2～4的比例傳代，并加入重組人bFGF，置于37℃、5％CO2、90％濕度條件下培養，傳代3次后，消化細胞，離心，棄上清后，將細胞濃度調制6×106/ml；每次傳代時都加入重組人bFGF。具體的，步驟2)的具體操作如下：用含有15％胎牛血清的DMEM調定成纖維細胞密度以每毫升2～4×105細胞接種于75cm2培養瓶，37℃、5％CO2、90％濕度條件下培養；當培養的成纖維細胞長成單層后，用無鈣鎂離子的PBS漂洗1次，加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS消化液消化2～3min；加入含有15％胎牛血清的DMEM培養基吹打終止消化，以1/2～4的比例傳代，并加入50～500ng/ml的重組人bFGF，置于37C、5％CO2、90％濕度條件下培養；當傳代3次后的成纖維細胞生長至培養瓶70～80％，單層，即按上述步驟消化細胞，離心，棄上清后，將細胞濃度調制6×106/ml，備用。其中，步驟3)所述的滅活采用輻照方式。具體的，所述的輻照即對制備成纖維細胞疫苗胞使用10～100Gy的X射線輻照。本專利技術還提供了所述的成纖維細胞疫苗在制備抗器官纖維化藥物中的用途。所述的成纖維細胞疫苗在制備抗肝纖維化、肺纖維化或腎纖維化藥物中的用途。本專利技術還提供了所述成纖維細胞疫苗的制備方法在制備抗器官纖維化藥物中的用途。本專利技術中的滅活，是指使成纖維細胞失去增殖的能力，但是可以保持生存狀態。本專利技術中的激活，是指使成纖維細胞經人bFGF刺激后，提高表達成纖維細胞激活蛋白FAP和α平滑肌肌動蛋白alpha-SMA的能力。本專利技術中，為了構建好的成纖維細胞疫苗，檢測了多個bFGF刺激的濃度，結果發現，50～500ng/ml的bFGF可以有效地激活成纖維細胞，使成纖維細胞表達成纖維細胞激活蛋白FAP和α平滑肌肌動蛋白alpha-SMA。本專利技術又對不同劑量的X射線進行了篩選，發現使用10～100Gy的X射線輻照能使成纖維細胞失去增殖的能力，并保持生存狀態。本領域技術人員容易理解，上述步驟2)中所述的培養是指含有滿足正常成纖維細胞生長所需物質的培養基如DMEM培養基等常規的細胞培養基)對細胞進行培養。加入bFGF共同培養時間根據細胞具體的生長情況和需要使用的具體數量確定即可。培養基只要是適合細胞生長，并不只限于本專利技術實施例所涉及的培養基種類。本專利技術的有益效果：本專利技術中，在前期使用小鼠的成纖維細胞做為疫苗治療纖維化時發現，成纖維細胞疫苗能夠有效地抑制小鼠肝纖維化和肺纖維化的發展，該疫苗能夠有效地誘導針對纖維化形成的免疫反應。這種疫苗具有很多優點，首先它取材方便，來源廣泛，從小鼠身體上取下1平方厘米的皮膚即可培養供30到50只小鼠使用的成纖維細胞疫苗；其次，它來自于受體本身，具有很好的安全性，不會存在嚴重的不良反應；最后，這種疫苗制備簡單，成本低廉，使用方便，具有很好的可推廣性。本專利技術的成纖維細胞疫苗的制備方法是在大量的篩選的基礎上得到的，具有免疫活性強、臨床安全性高等優點，是一種優秀的針對纖維化的成纖維細胞疫苗。本專利技術的成纖維細胞疫苗具有很好的免疫效果和抗炎癥效果，為疫苗的開發和應用提供了新的選擇。本專利技術技術簡單易行，可行性強，具有廣闊的應用前景。附圖說明圖1、本專利技術疫苗對肝纖維化的免疫效果；上兩張圖為CCl4模型組和治療組(MF免疫組，即鼠成纖維細胞疫苗免疫組，以下相同)肝組織的HE染色，下兩張分別為同時間點各組肝組織Masson染色照相。分別反映檢測各組小鼠肝臟病理損傷及纖維化程度。與成纖維細胞免疫組小鼠的肝組織比較，CCl4模型組小鼠鼠的肝臟體積均不規則縮小，表面不光滑，邊緣呈波浪狀，可見小結節狀增生。HE染色鏡下觀察發現模型組小鼠肝臟組織內肝小葉結構破壞明顯，肝細胞顆粒變性，有點狀壞死，失去肝索的正常排序，肝內血管擴張，間質內可見大量淋巴細胞浸潤，匯管區纖維增生，肝內有纖維間隔形成并分割包繞排列紊亂的肝細胞，即假小葉(圖1)。經成纖維細胞疫苗組治療組的小鼠的肝臟均小葉結構基本完整，肝細胞排列整齊，無明顯變性壞死，肝組織淋巴細胞浸潤較少。該研究結果說明成纖維細胞免疫能能減少CCl4引起的肝組織內淋巴細胞浸潤及肝組織結構的破壞，降低肝組織的脂肪變性和肝小葉中心壞死的程度，減輕了反復注射CC本文檔來自技高網...

【技術保護點】
成纖維細胞疫苗，其特征在于：其主要活性成分為滅活的由人堿性成纖維生長因子激活的成纖維細胞。

【技術特征摘要】
1.成纖維細胞疫苗，其特征在于：其主要活性成分為滅活的由人堿性成纖維生長因子激活的成纖維細胞。2.如權利要求1所述的成纖維細胞疫苗，其特征在于：所述的疫苗中成纖維細胞的劑量為1～10×105個細胞。3.權利要求1或2所述成纖維細胞疫苗的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：1)獲取原代成纖維細胞；2)在含有bFGF的培養基中刺激培養成纖維細胞；3)輻照滅活，分裝保存；前述3項操作均在無菌條件下完成。4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟1)的具體步驟如下：取小鼠背部及腹部的皮膚，PBS漂洗，Ⅰ型膠原酶消化，收集成纖維細胞。5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于：步驟1)的操作如下：切取小鼠背部及腹部的皮膚，置于含有100U/ml氨芐青霉素和100mg/ml硫酸鏈霉素的PBS中，反復經過PBS漂洗后，剪棄脂肪和結締組織；將皮膚剪成1mm3左右的小塊，加入含有1mg/mlⅠ型膠原酶的DMEM中，37℃孵育2～3小時，800g離心3min，收集成纖維細胞。6.如權利要求3～5任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中含人bFGF的培養基中bFGF的濃度為50～500ng/ml。7.如權利要求3～6任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟2)的具體步驟如下：用含有15％胎牛血清的DMEM調定成纖維細胞密度為2～4×105/毫升，37℃、5％CO2、90％濕度條件下培養，當培養的成纖維細胞長成單層后以1/2或1/4的比例傳代，并加入人bFGF，置于...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王震玲，楊莉，石華山，魏于全，
申請(專利權)人：四川大學，
類型：發明
國別省市：四川;51