冬蟲夏草中國被毛孢尿苷酸合成酶、編碼基因及其應用制造技術

本發明專利技術涉及一個來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與乳清酸核苷酸出發合成代謝尿苷酸的酶，編碼這個酶的基因及其應用；所述酶即為尿苷酸合成酶，氨基酸序列具有SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.3或SEQ?ID?No.5所示氨基酸序列90%以上同源性，其編碼基因對應具有SEQ?ID?No.2、SEQ?ID?No.4或SEQ?ID?No.6所示的核苷酸序列90%以上同源性；本發明專利技術從原理上對乳清酸核苷酸合成尿苷酸的代謝途徑進行了詳細研究，包含本發明專利技術所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉導、轉化、結合轉移的方法轉入工程菌中，通過調節尿苷酸生物合成基因的表達，賦予宿主尿苷酸的高表達性，為擴大尿苷酸的產量提供了有效途徑，具有重大應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一個來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢的參與乳清酸核苷酸成代謝尿苷酸的尿苷酸合成酶(uridine monophosphate synthetase),編碼這個酶的基因及其應用。
技術介紹
冬蟲夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統真菌藥材資源，具有代謝產物和生物活性多樣的特點，在生物醫藥領域展現出巨大的應用和發展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關注，在世界范圍內備受推崇。中醫認為，冬蟲夏草入肺腎二經，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調節陰陽的中藥?，F代藥理學已證實，冬蟲夏草具有免疫調節、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養、液體發酵等實際生產中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內外學者在冬蟲夏草資源調查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機理、開發應用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。天然蟲草具有嚴格的寄生性以及特殊的生態環境，故其產量很低，價格高昂。野生冬蟲夏草由于受生長環境等因素制約，資源匱乏。由于近幾年在人工栽培上進展不大，野生冬蟲夏草代用品研究多集中在液體發酵上。利用液體深層發酵培養冬蟲夏草菌絲體、提取物或發酵液，是解決冬蟲夏草藥源的一種有效途徑。蟲草發酵生產蟲草替代品，既可有效保護蟲草這一珍貴資源，又不受氣候、地理環境和蟲草寄生條件嚴格的限制，適合于工業化大規模生產。生產出的替代品如菌絲體其成分和藥效也與天然蟲草相似，因而國內外一直致力于蟲草菌絲體的發酵培養。人工發酵培養冬蟲夏草中國被毛孢得到的菌絲，經毒理、藥理、植化研究，證明與天然蟲草 化學組成、藥理作用基本一致，可代替天然蟲草生產蟲草制品，以彌補自然資源的短缺，通過對發酵條件的優化，菌絲體生物量和代謝產物的量均有明顯提聞。近年來，隨著天然產物化學和現代色譜技術的飛速發展，在對蟲草產品研發中已逐步由蟲草原料或粗提物的直接利用轉向更深層次的功能性代謝產物研究。國內外已對蟲草代謝產物做了大量的研究，代謝產物主要包括核苷、多糖、多肽、留醇等幾大類化合物，其中嘌呤類核苷、蟲草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代謝產物在生物合成、藥理作用等方面的研究初見成效。核苷類是蟲草最主要的活性物質之一，其中嘧啶類核苷包括胞嘧啶核苷和尿嘧啶核苷。尿喃唳核苷(uracil riboside)又稱尿苷(ulidine),別稱由雪核糖苷、二氫喃唳核苷、1-β-D-喃核糖基尿喃唳。胞喃唳核苷(cytosine riboside)又名胞苷(cytidine)、胞啶、l-β -D-呋喃核苷胞嘧啶。嘧啶核苷是多用途的核苷，可作為保健品和食品的添加劑。它作為美容和抗紫外輻射化妝品也逐漸成為人們生活的必需品，作為藥物，已臨床應用于中樞神經、泌尿、代謝和心血管等多方面的疾病，在美國，核酸類藥品近年來在抗病毒、抗腫瘤方面顯示了不可替代的作用。研究表明胞苷主要用于生產抗腫瘤、抗病毒藥物的中間體，隨著抗病毒、抗腫瘤、治療艾滋病藥物研制的深入，對天然嘧啶核苷的需求量加大。胞苷作為嘧啶核苷，主要用于生產抗腫瘤、抗病毒藥物的中間體，是制造阿糖胞苷(Ara — CR)、環胞苷(Cyclo C)、三磷酸胞苷(CTP)、胞二磷膽堿(⑶P— Choline)等藥物的主要原料。尿苷是一種天然的核苷，是所有其他嘧啶核苷酸的前體，尿苷酸是構成細胞核糖核酸的4種主要單核苷酸之一，具有嘧啶環結構，它參與糖原合成，有助于提高細胞的耐缺氧能力。它也是構成動物細胞核酸的成分，能提高機體抗體水平，尿苷及其衍生物還可以用來阻斷各種癌細胞和病毒的基因合成，治療癌癥和由病毒引起的疾病。由于嘧啶核苷及其類似物的重要生理作用，國內外有關微生物生產嘧啶類核苷已有很多研究。然而，作為重要合成代謝嘧啶類核苷的冬蟲夏草菌，還只停留在代謝產物成分分析和功效的研究上，對冬蟲夏草菌嘧啶類核苷合成代謝途徑中相關基因和蛋白的研究還很少見。
技術實現思路
`本專利技術目的在于針對以上存在的不足和需要解決的技術問題，對“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢合成代謝尿苷酸的酶及其編碼基因進行深入研究，提供了“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與乳清酸核苷酸出發合成代謝尿苷酸的酶(即尿苷酸合成酶)、編碼基因及其應用。本專利技術采用的技術方案是本專利技術提供一種來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與乳清酸核苷酸出發合成代謝尿苷酸的冬蟲夏草中國被毛孢尿苷酸合成酶所述酶具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列、SEQ ID No. 3所示氨基酸序列或SEQ ID No. 5所示氨基酸序列90%以上同源性，優選所述酶氨基酸序列為SEQ ID No.1的pynCl蛋白、序列為SEQ ID No. 3的pynC2蛋白或序列為SEQ ID No. 5的pynC3蛋白；該酶可催化乳清酸核苷酸制備尿苷酸。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID No.1、SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 5所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本專利技術保護范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結構或化學性質，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。本專利技術還涉及所述尿苷酸合成酶在生物催化乳清酸核苷酸制備尿苷酸中的應用。進一步，所述的應用為以含冬蟲夏草中國被毛孢尿苷酸合成酶菌體發酵培養獲得的濕菌體經細胞破碎后的破碎混合液為催化劑，以乳清酸核苷酸為底物，于PH為6. 5^8. 5的緩沖溶液構成的轉化體系中，在30°C、150rpm條件下轉化反應2 3h，反應結束后，將反應液過濾，取濾液即為含尿苷酸的粗品，所述粗品分離純化獲得尿苷酸。更進一步，所述底物的初始濃度為10g/L，所述催化劑的體積用量為100mL/g底物，所述催化劑的干菌體濃度為6. 7mg/mL。由乳清酸核苷酸合成代謝獲得尿苷酸的路徑如下式所示本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種冬蟲夏草中國被毛孢尿苷酸合成酶，其特征在于所述酶具有SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列、SEQ?ID?No.3所示氨基酸序列或SEQ?ID?No.5所示氨基酸序列90%以上同源性。

【技術特征摘要】
1.一種冬蟲夏草中國被毛孢尿苷酸合成酶，其特征在于所述酶具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列、SEQ ID No. 3所示氨基酸序列或SEQ ID No. 5所示氨基酸序列90%以上同源性。2.如權利要求1所述冬蟲夏草中國被毛孢尿苷酸合成酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列為SEQ ID No.1所示、SEQ ID No. 3所示或SEQ ID No. 5所示。3.如權利要求1所述冬蟲夏草中國被毛孢尿苷酸合成酶在生物催化乳清酸核苷酸制備尿苷酸中的應用。4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述的應用為以含冬蟲夏草中國被毛孢尿苷酸合成酶菌體發酵培養獲得的濕菌體經細胞破碎后的破碎混合液為催化劑，以乳清酸核苷酸為底物，于PH為6. 5^8. 5的緩沖溶液構成的轉化體系中，在30°C、150rpm條件下轉化反應2 3h，反應結束后，將反應液過濾，取濾液即為含尿苷酸的粗品，所述粗品分離純化獲得尿苷酸。5.如權利要求4所述的應...

【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭裕國，柳志強，吳暉，李邦良，吳玲芳，許靜，許峰，薛亞平，袁水金，王鴻艷，
申請(專利權)人：浙江工業大學，杭州中美華東制藥有限公司，
類型：發明
國別省市：