本發明專利技術涉及來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與尿素循環機制機理的精氨酸酶(Arginase)，編碼這個酶的基因及其應用。所述精氨酸酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其編碼基因核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本發明專利技術從原理上對L-精氨酸合成尿素進行了詳細研究，提供了“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與尿素循環機制機理的精氨酸酶及其編碼基因，本發明專利技術所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉導、轉化、結合轉移的方法轉入工程菌中，通過調節催化L-精氨酸制備相應的尿素的酶對應編碼基因的表達，賦予宿主精氨酸酶的高表達性，為擴大精氨酸酶的生物應用提供了有效途徑，具有重大應用前景。
【技術實現步驟摘要】
來自冬蟲夏草中國被毛孢的精氨酸酶、編碼基因及其應用(一)
本專利技術涉及一個來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與尿素循環機制機理的精氨酸酶(Arginase)，編碼這個酶的基因及其應用。(二)
技術介紹
冬蟲夏草(Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(HepialusarmoricanusOberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統真菌藥材資源，具有代謝產物和生物活性多樣的特點，在生物醫藥領域展現出巨大的應用和發展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關注，在世界范圍內備受推崇。中醫認為，冬蟲夏草入肺腎二經，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調節陰陽的中藥。現代藥理學已證實，冬蟲夏草具有免疫調節、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養、液體發酵等實際生產中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內外學者在冬蟲夏草資源調查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機理、開發應用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。但是，對冬蟲夏草中國被毛孢中尿素循環的研究幾乎為空白，尤其在參與中國被毛孢尿素循環的精氨酸酶的研究上。精氨酸酶(EC:3.5.3.1)是尿素循環中的一種酶，可催化精氨酸水解產生鳥氨酸和尿素，在機體氮代謝方面起著重要的作用。精氨酸作為一種半必須氨基酸，僅為快速增長的組織尤其是腫瘤組織所必需。一般含于產生尿素的動物(哺乳類、板鰓魚類、兩棲類、海龜類)的肝臟、腎臟、精巢中，作為尿素循環的一個環節而起作用。這種酶在肝細胞的核里特別多，也含于植物的種子、酵母和霉菌中。可為Fe2+、Co2+、Mn2+等二價金屬離子所激活，而Hg2+、Ag2+、檸檬酸和硼酸等可使之失活，另外可為賴氨酸、鳥氨酸所抑制，最適pH＝9.8。精氨酸酶通過分解精氨酸對腫瘤細胞進行營養剝奪，對正常組織影響較小，因此是一種良好的抗腫瘤藥物，眾多體內實驗證明，精氨酸酶有著顯著的抑制腫瘤細胞分裂的作用。1987年，YHaraguchi等人利用Oligo(dT)隨機引物和大鼠中精氨酸酶探針從人的肝臟細胞的cDNA文庫中篩選和克隆到了兩個精氨酸酶，分別命名為拉姆達hARG6和拉姆達hARG109，它們包含一個重疊的并且編碼322個氨基酸殘基開放讀碼框的cDNA序列。1996年，JosephG.Vockley等人PCR擴增出并克隆到了人II型精氨酸酶基因，這是有關哺乳動物非肝臟的精氨酸酶基因的首次報道。但是同源性比對后發現這個酶屬于I型精氨酸酶，而精氨酸酶的活力數據，和用anti-All抗體的免疫沉淀作用也同樣證實該基因和I型精氨酸酶的同源性。Northern印跡分析表明這個酶在腦，前列腺和腎中存在差異表達。2007年，楊成麗等人PCR擴增出了人I型精氨酸酶基因(hAI)，插入大腸桿菌表達載體pET30a中，構建重組表達質粒pET30a-hAI，轉化到大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)中，構建了大腸桿菌基因工程菌BL21(DE3)(pET30a-hAI)，IPTG誘導后表達，菌體酶活為每克濕菌體34.6U，分析表明，他們所克隆的目的蛋白大小大約為35kDa。2011年，劉巧林等人根據三角帆蚌消減雜交cDNA文庫獲得的EST序列，運用cDNA末端快速擴增(RapidamplificationofcDNAends，RACE)技術獲得了三角帆蚌精氨酸酶基因的全長cDNA序列。運用生物信息學方法分析表明精氨酸酶基因cDNA序列長1720bp，開放閱讀框(65-1072)1008bp，編碼335個氨基酸，5’端非編碼區為64bp，3’端非編碼區為648bp，軟件推測其編碼蛋白相對分子量為36.81kD。研究采用實時熒光定量PCR方法分析該基因在不同組織中的表達規律，結果表明，該基因在肝臟、胃、腸、鰓、心臟、外套膜、斧足共7個組織中都有表達，但主要集中在肝臟、胃和腸消化器官中表達。這可能說明低等的無脊椎動物三角帆蚌的精氨酸酶兼具有I型和Ⅱ型精氨酸酶的特征和功能，既可以參與尿素循環，又可以在生理和病理過程中發揮重要作用，但還需進一步驗證。但是，目前NCBI數據庫中目前還檢索不到中國被毛孢中精氨酸酶的基因相關信息。(三)
技術實現思路
本專利技術目的在于針對以上存在的不足和需要解決的技術問題，對“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢尿素循環中的酶及其編碼基因進行深入研究，提供了“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢尿素循環機制的一種精氨酸酶、編碼基因及其應用。本專利技術采用的技術方案是：一種參與中國被毛孢尿素循環的精氨酸酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示(記為argA蛋白)。該酶可催化L-精氨酸制備相應的尿素。SEQIDNo.1序列如下：MAFRGFNPRAGINPYQSWAKIVDCGDIPITPFDNDIAREQMTQALKSLGERASVSSLSPKPRLVTLGGDHSLTLPALRALNHVYGRPVRVLHFDAHLDTWNPEAYPSHWGATQFTHGSMFWMAKREGLLSNSSSEPSVHAGLRTRLSGDAWADYEDDGSQNWIRFAADDIDDRGTAGIIAGIMEALGTEDPVYLSVDIDVLDPAFAPGTGTPEPGGWTTRELIRVLRGIEGLDLVGADVVEVSPAYQGRGEETALAAAQVVYEGLTSM*由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQIDNO.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90％以上，均屬于本專利技術保護范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結構或化學性質，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。由L-精氨酸經過精氨酸酶的催化獲得對應尿素的路徑如下所示：本專利技術還涉及所述的精氨酸酶在生物催化L-精氨酸制備尿素中的應用，所述應用為：以本專利技術精氨酸酶作為催化劑，催化L-精氨酸制備得到尿素和鳥氨酸。具體的：將含精氨酸酶基因的重組工程菌經誘導培養后的濕菌體用磷酸鹽緩沖液(50mM、pH8.0)懸浮，超聲破碎，取破碎混合液離心，取上清液為催化劑，以0.1M的L精氨酸水溶液為底物，于pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液中，37℃下反應，反應結束后，將反應液離心，取上清液，獲得含尿素的混合液，將混合液分離純化即的尿素，所述分離純化的方法為本領域公知操作，通常采用親和層析的方法進行。所述底物的初始濃度為0.033M，所述催化劑的用量以超聲破碎前濕菌體的質量計為8.1g/L(終濃度)。所述催化劑按如下方法制備：將含精氨酸酶基因的重組工程菌接種于含終濃度50μg本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種來自冬蟲夏草中國被毛孢的精氨酸酶，其特征在于所述精氨酸酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。
【技術特征摘要】
1.一種來自冬蟲夏草中國被毛孢的精氨酸酶，其特征在于所述精氨酸酶的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.如權利要求1所述的精氨酸酶在生物催化L-精氨酸生成尿素中的應用。3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的應用為：將含精氨酸酶基因的重組工程菌經誘導培養后的濕菌體用pH8.0磷酸鹽緩沖液懸浮，超聲破碎，取破碎混合液離心，取上清液為催化劑，以0.1M的L精氨酸水溶液為底物，于pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液中，37℃下反應，反應結束后，將反應液離心，取上清液，獲得含尿素的混合液。4.如權利要求3所述的應用，其特征在于：所...
【專利技術屬性】
技術研發人員：柳志強，鄭裕國，林善，薛亞平，吳暉，李邦良，許靜，許峰，王鴻艷，
申請(專利權)人：浙江工業大學，杭州中美華東制藥有限公司，
類型：發明
國別省市：浙江;33
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