一種大量制備2-O位脫硫酸基酶、3-O位硫酸基轉移酶的方法技術

本發明專利技術利用實驗室保藏的分別攜帶2-O位脫硫酸化酶基因、3-O位硫酸基轉移酶基因的兩種質粒，首先通過轉化得到重組工程菌；然后在搖瓶中優化了重組菌的生長和誘導產酶等條件，得到大量的2-O位脫硫酸化酶與3-O位硫酸基轉移酶；最后將粗酶通過鎳柱(Ni-NTA?Agarose?Fast?Flow)進行純化，快速得到了純度高達90％的純酶。在搖瓶優化的基礎上，進行高密度發酵，采用提高單位體積菌體濃度的方法進一步提高了兩種酶的產量，能夠極大地降低兩種酶的生產成本，使工業化成為可能，為我們探索和研究肝素多糖的構效關系、硫酸乙酰肝素的作用奠定基礎。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種大量制備2-0位脫硫酸化酶、3-0位硫酸基轉移酶的方法。屬生物醫藥領域。
技術介紹
肝素應用于臨床的歷史已有近百年，主要用于抗凝血和抗血栓。然而肝素在臨床上尚存有較大的副作用，有時甚至可能導致致死性顱內出 血。這使得它的應用受到很大的限制。盡管這樣，臨床上仍然廣泛用于治療血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手術、體外循環、血液透析。人們試圖通過血液監測、減小劑量、局部用藥或使用新的劑型等以降低出血的危險性，從而最大限度的發揮肝素的治療作用。但目前都無法從根本上解決這個問題。然而硫酸乙酰肝素在很大程度上克服了肝素應用的副作用，同時具有類似肝素的抗炎、抗血栓和降血脂等生物作用。硫酸乙酰肝素又叫葡萄糖胺聚糖鏈，是一類具有電負性的大分子線性聚合物。它廣泛存在于哺乳動物以及一些植物體內。該聚合物在機體內不能游離存在，而是通過共價鍵結合在核心蛋白的絲氨酸與甘氨酸殘基上共同組成硫酸乙酰蛋白聚糖。在肝素的基礎上進行脫硫酸化與硫酸化得到硫酸乙酰肝素成為現在研究的一個熱門研究。肝素的脫硫酸化修飾主要是在肝素結構的2-0-硫酸基、3-0-硫酸基、N-硫酸基、6-0-硫酸基位點。用硅烷化試劑制得6-0-硫酸基完全脫去的肝素，并沒有發現其它副反應和解聚現象(Kariya Y, Kyogashima M, Suzuki K, et al. J Biol Chem, 2000, 275 25949-25958)。現研究發現不同位點的脫硫酸化肝素能不用程度抑制血小板與血纖蛋白和血漿蛋白的粘附，其作用強弱為6-0-脫硫酸基> N-脫硫酸基> 2-0-脫硫酸基> 3-0-脫硫酸基產物，由此可見脫硫酸化肝素也可開發為抗血栓藥物(Baumann H. Semin ThrombHemost, 2001,27 =445-463.)。并有研究發現6-0和N-脫硫酸化肝素可降低肝素的抗病毒活性，而2-0和3-0位脫硫酸化肝素則基本無影響(Herold B C,Gerber S I,Polonsky T,et al. Virology, 1995, 206 :1108-1116)?，F研究也表明硫酸乙酰肝素的抗凝血活性主要通過含有3-位硫酸基氨基葡萄糖的戊糖活性中心結合抗凝血酶(AT-III)，誘導其發生構象改變，從而顯示抗凝血活性。其中3-0-位硫酸化由3-0ST完成。這些硫酸基轉移酶大多具有多種異構型式，其中，3-0ST-1和3-0ST-5能合成肝素戊糖活性中心。現有研究表明肝素及低分子量肝素都是3-0ST-1和3-0ST-5很好的底物(J. Chen, M. B. Duncan, K. Carricket.，Glycobiology,2003,13 :785-794)。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種大量制備2-0位脫硫酸化酶、3-0位硫酸基轉移酶的方法具體技術方案為利用實驗室保藏的分別攜帶2-0位脫硫酸化酶基因、3-0位硫酸基轉移酶基因的兩種質粒，通過轉化得到大腸桿菌重組工程菌；將工程菌按1%接種在帶有抗生素卡那霉素的LB培養基中進行菌種活化，活化后接種到裝有IOOml培養基的搖瓶中培養一段時間，對重組菌進行誘導產酶優化，分別優化誘導前菌體濃度、誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的濃度、誘導溫度、誘導時間等條件，得到大量含有2-0位脫硫酸化酶與3-0位硫酸基轉移酶的菌體溶液；將菌液倒入離心杯4°C離心，倒掉離心杯中的上清液，用bufferA將離心杯中菌體洗脫下來，在冰浴下超生破碎，離心破碎后的菌液，取上清粗酶液，將粗酶液通過鎳柱(Ni-NTA Agarose Fast Flow)，上樣完后靜止30min讓酶充分與鎳柱螯合，再用BufTerA洗脫雜蛋白，然后用bufferB將螯合的酶洗脫下來，得到了純度高達90%的純酶；在搖瓶優化的基礎上，將工程菌活化，接種到高密度發酵培養基中進行高密度發酵，控制好溫度、PH值、溶氧量、流加速度、誘導前菌體濃度0D600值等條件，采用提高單位體積菌體濃度的方法進一步提高了兩種酶的產量。本專利技術能夠降低兩種酶的生產成本，為其工業化生產提供了新的途徑。所述方法中，加入的抗生素卡那霉素為20mg/mL-100mg/ml,優選50mg/ml。 所述方法中，兩種重組菌的誘導前，在600納米下測定的吸光度值(0D600)為O. 6-3. 0，優選 O. 6-0. 8。所述方法中，兩種重組菌的誘導劑IPTG的濃度為O. 6mM-2. OmM。優選IPTG的濃度為 I. 2mM。所述方法中，兩種重組菌的誘導溫度為16°C -30°c，優選誘導溫度為20°C。所述方法中，兩種重組菌的誘導時間為6_16h，優選誘導時間為10h。所述方法中，上柱緩沖液Buffer A 25mM Tris，0.5M NaCl，IOmM 咪唑，pH 7.0。所述方法中，上柱緩沖液Buffer B 25mM Tris,0. 5M NaCl，500mM 咪唑，pH 7. 0所述方法中，高密度發酵的配方(IL)為:KH2P04，13.5g; (NH4)2HPO4,4. Og5MgSO47H20,1. 4g ;梓檬酸，I. 7g ;微量金屬離子，10ml。微量金屬離子包含以下金屬離子(5M/L HCl溶解)FeS04 7H20,10g/L ；CaCl2 2H20,2. Og/L ；ZnS04 7H20, 2. 2g/L ；MnS04 4H20,0. 5g/L ；CuSO4 5H20，I. Og/L ； (NH4) 6Mo7P0244H20，0. lg/L ；Na2B4O7 IOH20,0. 02g/L。再加 20g/L 的葡萄糖。調節pH值為7.0。所述方法中，流加液為500g/L的葡萄糖與20g/L MgSO4 7H20的混合液，流加速度為 6. 0ml/mino所述方法中，高密度發酵時的誘導0D600值為60左右，誘導后的0D600值為140左右。具體實施例方式下述實施例將具體說明本專利技術的操作方法，但不能作為對本專利技術的限定。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。實施例I、重組菌的培養條件優化活化所需菌種，接種IOOul菌液入10ml LB培養液中，根據質粒的抗性加入IOul抗生素卡那霉素(50mg/mL)，搖床37°C，200rpm培養過夜。再分別在IOOml培養液中接種Iml已活化的菌液，并加入抗生素lOOul，搖床37°C ;200rpm培養。培養大概2. 5小時，測定0D600，加入誘導劑IPTG誘導，將搖瓶放在搖床上進行低溫誘導，誘導10小時左右取出搖瓶，將搖瓶中菌液倒入離心杯中，4000rpm，4°C離心菌液20min。離心后，棄去上清，離心杯中菌體用40ml BufferA洗下來,冰浴,并加入IOmg溶菌酶。再超聲波破碎,超聲條件超聲5S,暫停8S，功率400W，99個循環，共超聲3遍，冰水浴。超聲完，lOOOOrmp，4°C下離心45min以上，取上清液。實施例2、2-0位脫硫酸化酶與3-0位硫酸基轉移酶的純化上柱前用Buffer A平衡5個柱床體積，流速為2mL/min。再將上清液粗酶上柱，流速為lml/min,為了提本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種大量制備2？O位脫硫酸化酶、3？O位硫酸基轉移酶的方法，是利用實驗室保藏的分別攜帶2？O位脫硫酸化酶基因、3？O位硫酸基轉移酶基因的兩種質粒，首先通過轉化得到大腸桿菌重組工程菌；然后在搖瓶中進行了兩種重組菌產酶條件的優化，得到了最佳的誘導前菌體濃度、誘導劑IPTG.濃度、誘導溫度、誘導時間，同時制備了大量的2？O位脫硫酸化酶與3？O位硫酸基轉移酶；最后將粗酶通過鎳柱(Ni？NTA？Agarose？Fast？Flow)進行純化，快速得到了純度高達90％的純酶；在搖瓶優化的基礎上，將工程菌接種到高密度發酵培養基中進行高密度發酵，采用提高單位體積菌體濃度的方法進一步提高了兩種酶的產量。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳敬華，周斌，劉衛超，王敏，程詠梅，滕麗萍，鄧超，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：