本發明專利技術涉及微生物代謝產物技術領域，具體為一種解淀粉芽孢桿菌Q-426及其脂肽的分離方法，解淀粉芽孢桿菌Q-426易培養，對營養要求不高，在很寬的溫度及pH值范圍內均能很好地生長，具有廣譜的抗真菌活性，對多種腫瘤細胞具有較強的抑制作用；脂肽的分離方法主要包括：發酵培養、酸沉淀、清洗、抽提、濃縮、陽離子交換樹脂吸附、色譜層析樹脂吸附與解吸、半制備型高效液相色譜儀收集八個步驟。本發明專利技術構建了一套多種脂肽組分同步分離的方法，該方法較以前的活性炭吸附法、大孔樹脂吸附法及柱層析法有著明顯的優點，能夠獲得單一組分，且純度、收率均較高，純化所需時間明顯縮短。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及解淀粉芽孢桿菌Q-426及其脂肽的分離方法，屬于微生物代謝產物
技術介紹
解淀粉芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一個種，具有較強的次級代謝產物生產能力，可以產生多種具有生物活性的代謝產物，脂肽是其中一種重要的代謝產物，是由短肽和脂肪酸鏈組成的兩性分子:多個氨基酸組成的肽鏈形成親水基，脂肪烴鏈形成親油基。由于其特殊的化學結構，脂肽物質具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒等多種生物學活性，并且具有耐熱、耐酸、對蛋白酶穩定、低毒、低抗藥性等優點。脂肽除了具有抑菌活性外，還是一種生物表面活性劑，具有天然、高效及低毒的優勢，在食品、醫藥、采油、化妝品及環境治理領域具有廣泛的應用前景。目前已從微生物發酵產物中發現十多種脂肽類化合物，包括芬養素(fengycins)、表面活性素(surfactins)、達托霉素(daptomycins)、芽孢菌霉素(bacillomycins)、抗霉枯草菌素(mycosubtilins)、棘白霉素(echinocandins)、制磷脂菌素(plipstatins)和伊枯草菌素(iturins)等。現有技術中，解淀粉芽孢桿菌代謝產物單一，抗菌活性低，抗腫瘤活性低。工業發酵生產中的后提取和產品的精制過程是保證目標代謝物達到一定純度并投入市場的一個重要環節，下游分離純化過程的成本約占整個發酵生產成本的三分之二以上。因此，分離純化過程無疑是保證產品質量、決定其經濟效益的關鍵所在。脂肽的分離純化主要是依據其理化性質，根據脂肽的理化性質的不同，對其粗提物通過酸沉淀、萃取、柱層析、反向高效液相色譜制備等手段進行分離純化。利用傳統的沉淀法得到的脂肽產品收率和純度較低，單一組分純化困難，不能滿足實際應用的要求，而有機溶劑萃取法需要使用大量的有毒化學試劑如二氯甲烷、氯仿等，使產品中殘留少量的有毒物，在實際應用中存在安全隱患，同時有機溶劑的加入會造成脂肽的生物活性部分喪失。近年來，根據脂肽物質的結構特點，逐漸發展了超濾、吸附法、泡沫分離法、色譜法和液膜分離法等新型分離技術，并出現了這些相關技術的組合應用，從而達到使分離純化過程更加簡單和具有針對性。總體來說，對于脂肽的分離純化，大多還只停留在實驗室水平上的粗提，純化方法和手段大體上是酸沉和大孔吸附樹脂層析的簡單組合，不能同時對多種脂肽組分進行分離。
技術實現思路
為了解決上述技術問題，本專利技術的第一個目的是提供一種解淀粉芽孢桿菌Q-426(Bacillus amyloliquefaciens)。本專利技術的另一個目的是提供用于所述解淀粉芽孢桿菌Q-426(BacilluSamyloliquefaciens)脂肽的分離方法。本專利技術的技術方案如下:一種解淀粉芽孢桿菌Q-426，其保藏編號為CCTCC N0.M 2010237。所述的解淀粉芽孢桿菌是專利技術人在遼寧省大連市有堆肥中分離得到的，經傳統和分子生物學方法鑒定為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens。所述的解淀粉芽孢桿菌Q-426已于2010年9月17日提交保藏，具體保藏信息如下:保藏單位名稱:中國典型培養物保藏中心CCTCC ；保藏單位地址:中國武漢武漢大學；保藏日期:2010年9月17日；保藏編號:CCTCCN0.M 2010237ο所述的解淀粉芽孢桿菌Q-426 (Bacillus amyloliquefaciens)的形態特征為:菌體呈短桿狀，具有運動性，兼性厭氧，可形成內生芽孢，芽孢囊膨大，呈橢圓形，游離芽孢表面著色弱，Gram染色陽性。在LB培養基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規則，在多種培養基上均不產色素。用于所述解淀粉芽孢桿菌Q-426脂肽的分離方法，包括如下步驟:(I)發酵培養:解淀粉芽孢桿菌經活化、一級種子培養、發酵后，得發酵液；(2)酸沉淀:發酵液離心去除菌體，取上清液，將上清液調pH至2.0-3.0進行酸沉淀，離心得沉淀；(3)清洗:使用超純水清洗步驟(2)所得沉淀；(4)抽提:使用100wt%甲醇重懸步驟(3)清洗后的沉淀，離心留上清液；(5)濃縮:將步驟(4)所得上清液濃縮，得粗提樣I ;(6)吸附:向陽離子交換樹脂的層析柱中加入粗提樣I，用甲50wt%醇溶液洗脫；將流出液蒸發去除甲醇，調PH至2.0-3.0,離心去除上清液留沉淀，將沉淀用超純水溶解，得粗提樣II ;(7)吸附與解吸:向色譜層析樹脂中加入粗提樣II，靜態吸附7-10h ;將吸附粗提樣II的色譜層析樹脂進行裝柱，用40-60被％甲醇溶液洗脫后；再用80-100被％甲醇溶液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液蒸干后，用超純水溶解，得粗提樣III ;(8)半制備型高效液相色譜儀收集:將粗提樣III使用半制備型高效液相色譜按峰收集純化，從而實現脂肽的分離。進一步的，所述的分離方法包括如下步驟:(I)發酵培養:解淀粉芽孢桿菌經活化、一級種子培養、發酵后，得發酵液；(2)酸沉淀:發酵液離心去除菌體，取上清液，將上清液調pH至2.0進行酸沉淀，離心得沉淀；(3)清洗:使用超純水清洗步驟(2)所得沉淀；(4)抽提:使用100wt%甲醇重懸步驟(3)清洗后的沉淀，離心留上清液；(5)濃縮:將步驟(4)所得上清液于42°C蒸發濃縮，得粗提樣I ;(6)吸附:向陽離子交換樹脂的層析柱中加入粗提樣I，用50wt%的甲醇溶液以3BV/h的流速沖洗樹脂；將流出液蒸發去除甲醇，調pH至2.0,離心去除上清液留沉淀，將沉淀用超純水溶解，得粗提樣II ;(7)吸附與解吸:向色譜層析樹脂中加入粗提樣II，置于4°C，lOOrpm靜態吸附8h ；將吸附了粗提樣II的色譜層析樹脂進行裝柱，用50wt%甲醇溶液以6BV/h的流速洗脫；再用90wt%甲醇溶液以3BV/h的流速洗脫，收集洗脫液；將洗脫液蒸干后，用超純水溶解，得粗提樣III ;(8)半制備型高效液相色譜儀收集:將粗提樣III使用半制備型高效液相色譜按峰收集純化，色譜柱為C18，檢測波長為220nm，從而實現脂肽的分離。本專利技術的分離方法以解淀粉芽孢桿菌的發酵液為樣品，通過酸沉淀、甲醇抽提、雙樹脂聯合純化，半制備型高效液相色譜分離，構建了一套多種脂肽組分同步分離純化的方法，該方法較以前的活性炭吸附法、大孔樹脂吸附法及柱層析法有著明顯的優點，能夠獲得單一組分，且純度、收率均較高，純化所需時間明顯縮短。本專利技術的有益效果如下:(1)本專利技術提供的解淀粉芽孢桿菌Q-426，易培養，對營養要求不高，在很寬的溫度及pH值范圍內均能很好地生長，具有廣譜的抗真菌活性，對多種腫瘤細胞具有較強的抑制作用；(2)本專利技術提供的分離方法，能夠同時對多種脂肽組分進行分離，終產品的純度尚;(3)本專利技術提供的分離方法具有純化產率高、分離周期短、工藝工序簡便易學，操作性控制性強、環境更為友好等優勢；(4)本專利技術提供的分離方法，只涉及甲醇一種有機溶劑，大大減少了環境污染，濃縮后的甲醇因其為單一溶劑還可回收再利用，提高了溶劑利用率。【附圖說明】圖1為粗提樣I的尚效液相檢測圖；圖2為粗提樣III的尚效液相檢測圖；圖3為分離純化的脂肽a高效液相檢測圖；圖4為分離純化的脂肽b高效液相檢測圖；圖5為分離純化的脂肽c高效液相檢測圖；圖6為分離純化的脂肽d高效液相檢測圖；圖7為分離純化的脂肽e高效本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)Q?426，其特征在于，保藏編號為CCTCC?NO.M?2010237。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：權春善，金黎明，鄭維，周偉，劉靜，范圣第，
申請(專利權)人：大連民族大學，
類型：發明
國別省市：遼寧;21
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