一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶及其基因和應用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-arabinose?isomerase，L-AI)及其基因和制備方法，以及利用該酶制備D-塔格糖(D-tagatose)的方法。尤其用枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)表達L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，獲得了具有生物活性的重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，該酶更有利于塔格糖的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明專利技術(shù)的方法具有簡單、高效、周期短的特點。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
,具體涉及一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-arabinoseisomerase)及其基因和制備方法，以及利用該酶制備D-塔格糖(D-tagatose)的方法。
技術(shù)介紹
塔格糖是一種在自然界中存在較少的單糖，在苔蘚、地衣等低等植物以及加熱過的牛乳、乳粉、酸乳、干酪等乳制品中有少量存在。塔格糖是一種己酮糖，其甜度為蔗糖的92%，而熱量值只有1. 5kcal/g。純凈的塔格糖為白色無水晶體物質(zhì)，無臭，熔點134°C。塔格糖具有良好的功能特性，如糖尿病人食用后可以抑制和減緩血糖的升高；在加熱和烘烤過程中發(fā)生美拉德反應，產(chǎn)生良好色澤，可以作為蔗糖的替代品或和其它甜味劑復配使用；進入結(jié)腸后，被其中的微生物菌群選擇性發(fā)酵，促進有益菌增殖，抑制有害菌生長，明顯改善腸道菌群，是一種很好的益生素。大量的安全毒理學試驗表明，塔格糖安全無毒，因此被美國FDA批準為GRAS (generally regarded as safe),目前被允許作為甜味劑加入食品、飲料、保健品等中。塔格糖的生產(chǎn)方法包括天然提取分離法、化學催化合成法以及生物轉(zhuǎn)化法等。塔格糖是一種較為罕見的單糖，在自然界的含量極低，提取分離成本高，不適宜工業(yè)化大生產(chǎn)。化學催化法也存在許多不利的因素，如化學污染物多，副產(chǎn)物多，分離困難等。因此，近年來對塔格糖生產(chǎn)的研究主要集中在生物轉(zhuǎn)化法上。研究發(fā)現(xiàn)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(EC5.3. 1.4, L-arabinose isomerase, L-AI)可以催化D-半乳糖轉(zhuǎn)化生成D-塔格糖,是目前生物法生產(chǎn)D-塔格糖最為有效的途徑。D-塔格糖的工業(yè)化生產(chǎn)要求L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的最適反應pH最好在5. 0 6. 0之間，最適反應溫度最好在60 80°C之間，這有利于提高反應速度，減少非特異性反應 ，避免褐變反應。然而，目前報道的天然L-阿拉伯糖異構(gòu)酶無法同時在pH和溫度等方面滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
技術(shù)實現(xiàn)思路
因此，本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題就是針對天然L-阿拉伯糖異構(gòu)酶無法同時在pH和溫度等方面滿足生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D-塔格糖的要求，提供一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶及其基因和制備方法，以及利用該酶制備D-塔格糖的方法。本專利技術(shù)的第一方面是提供一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，它的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 2所示。本專利技術(shù)第二方面提供一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因，它的核苷酸序列是以下的任何一種I)序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；2)編碼氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示蛋白的核苷酸序列。本專利技術(shù)中，SEQ ID No.1所示核苷酸序列全長1488，編碼496個氨基酸，所用密碼子有利于該基因在枯草芽孢桿菌(Bacillus subti I is)中表達。本專利技術(shù)中，氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的蛋白為L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。所有編碼該氨基酸序列的核苷酸序列都在本專利技術(shù)的范圍之內(nèi)。本專利技術(shù)的第三方面是提供含有如上所述的重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的重組載體。所述的重組載體所用的載體是本領(lǐng)域的常規(guī)載體，包括克隆載體和表達載體。較佳的如克隆載體pUC57。也可以是大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體，較佳的如穿梭載體pMA5。本專利技術(shù)的第四方面是提供含有如上所述的重組載體的轉(zhuǎn)化子。所述的轉(zhuǎn)化子的宿主細胞是本領(lǐng)域常規(guī)的宿主細胞，如大腸桿菌，優(yōu)選枯草芽孢桿菌，更優(yōu)選枯草芽孢桿菌WB600。該轉(zhuǎn)化子較佳的是表達重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因工程菌，優(yōu)選枯草芽孢桿菌，如枯草芽孢桿菌WB600。本專利技術(shù)的第五方面提供一種制備表達重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因工程菌的方法，包括以下步驟I)合成氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因；2)將步驟I)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因克隆入枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭載體中構(gòu)建重組載體，然后將重組載體導入枯草芽孢桿菌表達菌株獲得重組枯草芽孢桿菌，即得表達L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因工程菌。本專利技術(shù)中，步驟I)所述的合成氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因的方法是常規(guī)方法，可以人工合成基因。所述的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因的核苷酸序列可以是任何編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的核苷酸序列，較佳的是序列表中SEQID No.1所示的核苷酸序列。所述的枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭載體優(yōu)選質(zhì)粒PMA5。所述的枯草芽孢桿菌表達菌株優(yōu)選枯草芽孢桿菌WB600。本專利技術(shù)的 一較佳實施例是利用引物擴增獲得所述的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因。該方法是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，以步驟I)所合成的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因為模板擴增得到L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因。所述的引物是上游引物TG_F的序列為Sy-GGAATTCCATATGATGCTGTCATTACGTCC-3’，下游引物 TG_R 的序列為 5’ -GAGGATCCTTACCGCCCCCGCCAGAATACT-3’ ;分別具有Nde I和BamH I酶切位點。本專利技術(shù)所述的將L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因克隆入枯草芽孢桿菌表達載體的克隆方法是本領(lǐng)域常規(guī)方法。較佳的，如上利用引物TG_F和TG_R擴增獲得L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因，通過Xho I和Xba I酶切位點構(gòu)建含有L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因的重組載體pMA5-araA，然后用電轉(zhuǎn)化法將其導入枯草芽孢桿菌中，利用卡那霉素抗性篩選重組菌株，最后誘導重組枯草芽孢桿菌表達L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。本專利技術(shù)的第六方面提供一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的制備方法，包括培養(yǎng)本專利技術(shù)所述的轉(zhuǎn)化子，從發(fā)酵產(chǎn)物中分離重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。較佳的所述的轉(zhuǎn)化子是枯草芽孢桿菌。本專利技術(shù)的第七方面提供一種生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D-塔格糖的方法，包括采用L-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化D-半乳糖轉(zhuǎn)化生成D-塔格糖，其中，所用的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶是氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。該重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶優(yōu)選用本專利技術(shù)所述的方法制備而得。本專利技術(shù)所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本專利技術(shù)的有益效果如下本專利技術(shù)提供一種L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-arabinose isomerase, L-AI)及其基因和制備方法，以及利用該酶制備塔格糖的方法。尤其用枯草芽孢桿菌表達L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，獲得了具有生物活性的重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，該酶更有利于塔格糖的工業(yè)化生產(chǎn)。本專利技術(shù)的方法具有簡單、高效、周期短的特點。附圖說明以下結(jié)合附圖說明本專利技術(shù)的特征和有益效果。圖1為擴增araA基因的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，1、2、3 araA基因(引物物TG_F 和 TG_R)，M :分子量 Marker DL2000。圖2為重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖，其中，Ml :分子量Marker DL2000, M2 :分子量Marker DL5000,1 :經(jīng) Nde I 酶切的 pMA5-araA, 2 :經(jīng) BamHI 酶切的 pMA5-araA, 3 :經(jīng) Nde I和BamH I雙酶切的pMA5_araA,4 :未酶切的pMA5_araA。圖3為重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶SDS-PAGE檢測結(jié)果，其中，M :蛋白質(zhì)分子量標準(寬)，I 9 本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種重組L?阿拉伯糖異構(gòu)酶，其特征在于，其氨基酸序列是序列表中SEQ?ID?No.2所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，其特征在于，其氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 2所示。2.一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因，其特征在于，其核苷酸序列是以下的任何一種 1)序列表中SEQID No.1所示的核苷酸序列； 2)編碼氨基酸序列如序列表中SEQID No. 2所示蛋白的核苷酸序列。3.含有如權(quán)利要求2所述的重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因的重組載體。4.含有如權(quán)利要求3所述的重組載體的轉(zhuǎn)化子。5.一種制備表達重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)合成氨基酸序列如序列表中SEQID No. 2所示的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因； 2)將步驟I)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因克隆入枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭載體中構(gòu)建重組載體，然后將重組載體導入枯草芽孢桿菌表達菌株獲得重組枯草芽孢桿...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱寶泉，林軍，胡海峰，胡又佳，
申請(專利權(quán))人：上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，
類型：發(fā)明
國別省市：