一種亞油酸異構(gòu)酶突變體及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種亞油酸異構(gòu)酶突變體及其應(yīng)用，所述突變體由氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示的亞油酸異構(gòu)酶第62位蛋氨酸突變?yōu)楸彼峄蚋拾彼幔?或第295位絲氨酸突變?yōu)楸彼帷⒘涟彼峄蚶i氨酸得到。本發(fā)明專利技術(shù)亞油酸異構(gòu)酶突變體與野生型酶相比，催化亞油酸獲得反?10,順?12共軛亞油酸的酶活力得到了大大的提高，特別是雙突變時，如M62A/S295L，M62A/S295A，M62A/S295V，M62G/S295L，M62G/S295A，M62G/S295V，能夠提高10倍左右，具備良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種亞油酸異構(gòu)酶突變體及其應(yīng)用(一)
本專利技術(shù)涉及一種亞油酸異構(gòu)酶突變體及其應(yīng)用。(二)
技術(shù)介紹
共軛亞油酸(Conjugatedlinoleicacid，CLA)是具有共軛雙鍵的十八碳二烯酸的統(tǒng)稱，具有抗癌、抗氧化、抗心血管疾病及減輕體重的作用。美國FDA于2008年、歐洲國家2012年批準(zhǔn)CLA作為食品添加劑使用，我國2009年批準(zhǔn)CLA為新資源食品，市場需求巨大。反芻動物肉、奶及其制品是CLA的天然食物來源，但含量較低。CLA也可以以亞油酸(linoleicacid；LA)為底物，通過堿催化異構(gòu)化反應(yīng)化學(xué)生成，但產(chǎn)物是c-9,t-11CLA和t-10,c-12CLA的兩種異構(gòu)體的混合物，分離、純化困難，且產(chǎn)物中混有對食用具有安全隱患的脂肪酸環(huán)化副產(chǎn)物。自然界中某些微生物含有亞油酸異構(gòu)酶(LinoleateIsomerase,PAI)，來源于痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)的PAI是目前唯一已知晶體結(jié)構(gòu)的亞油酸異構(gòu)酶，能催化LA為t-10,c-12CLA。目前已經(jīng)有一些研究借助基因工程技術(shù)構(gòu)建具有產(chǎn)PAI活力的工程菌株，但酶活力均不夠理想，達(dá)不到工業(yè)應(yīng)用的水平?；趯Φ鞍踪|(zhì)晶體結(jié)構(gòu)認(rèn)識基礎(chǔ)上的酶蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)在酶工程領(lǐng)域已有大量的研究和應(yīng)用，通過對酶蛋白活性中心相應(yīng)氨基酸殘基的突變，再進(jìn)行篩選，可以獲得催化活性顯著提高的突變酶，因此，可以利用該基因改造技術(shù)提高PAI的催化活性。(三)
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的是提供一種亞油酸異構(gòu)酶突變體及其應(yīng)用，該亞油酸異構(gòu)酶突變體具有很好的催化亞油酸合成共軛亞油酸的活力，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。野生型亞油酸異構(gòu)酶(PAI；GeneBank號為AX062088)來源于痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)，但野生型亞油酸異構(gòu)酶催化亞油酸獲得反-10,順-12共軛亞油酸(trans-10,cis-12conjugatedlinoleicacid；t-10,c-12CLA)的活性較弱，目前還不具備實際工業(yè)應(yīng)用價值。如果能夠通過基因工程改造，提高其酶活性，則其具備相應(yīng)的工業(yè)應(yīng)用價值。本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案是：通過對野生型亞油酸異構(gòu)酶活性區(qū)域進(jìn)行理性設(shè)計并定點突變，對多個位點進(jìn)行飽和定點突變，再表達(dá)純化后進(jìn)行酶活力進(jìn)行檢測，本專利技術(shù)提供一種亞油酸異構(gòu)酶突變體，所述突變體由氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的亞油酸異構(gòu)酶第62位蛋氨酸突變?yōu)楸彼峄蚋拾彼?，?或第295位絲氨酸突變?yōu)楸彼?、亮氨酸或纈氨酸得到。進(jìn)一步，所述突變體是將第62位蛋氨酸突變?yōu)楸彼峄蚋拾彼?，同時第295位絲氨酸突變?yōu)楸彼?、亮氨酸或纈氨酸。組合后產(chǎn)生的6種雙突變酶，經(jīng)檢測酶活力能夠提高10倍左右，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。為了方便本專利技術(shù)亞油酸異構(gòu)酶突變體表達(dá)后的純化，優(yōu)選的，所述的亞油酸異構(gòu)酶突變體的N端或C端連接有用于蛋白純化的標(biāo)簽。更優(yōu)選的，所述標(biāo)簽為組氨酸標(biāo)簽。組氨酸標(biāo)簽本身較小，一般常用6個組氨酸，且純化步驟方便。本專利技術(shù)還提供一種所述亞油酸異構(gòu)酶突變體的編碼基因，由所述編碼基因構(gòu)建的重組載體，以及由所述重組載體轉(zhuǎn)化制備的重組基因工程菌。此外，本專利技術(shù)還提供一種所述亞油酸異構(gòu)酶突變體在催化亞油酸制備共軛亞油酸中的應(yīng)用，具體所述的應(yīng)用為：以含亞油酸異構(gòu)酶突變體編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)液超聲破碎后提取的純酶為催化劑，以亞油酸為底物，以吐溫-80為助劑，于pH6.7、25mM磷酸緩沖液中，40℃水浴攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液分離純化，獲得(10E,12Z)-共軛亞油酸。所述催化劑用量以緩沖液體積計為250～4000U/ml(優(yōu)選314U/ml)，所述底物用量以緩沖液體積計為50～150g/L(優(yōu)選125g/L)，所述助劑體積用量以緩沖液體積計為5-15％(優(yōu)選12.5％)。進(jìn)一步，所述催化劑按如下方法制備：(1)將含亞油酸異構(gòu)酶突變體編碼基因的重組基因工程菌接種于LB固體平板，37℃培養(yǎng)18小時，挑取重組轉(zhuǎn)化子并接種于LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18小時，獲得重組轉(zhuǎn)化子；所述LB液體培養(yǎng)基質(zhì)量組成為：1％蛋白胨、0.5％酵母浸出粉、1％氯化鈉，溶劑為水，pH值自然；LB固體培養(yǎng)基即在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加質(zhì)量濃度1.5％瓊脂粉；(2)將重組轉(zhuǎn)化子接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃、200rpm搖床中震蕩培養(yǎng)，至OD600達(dá)到0.4～0.5，獲得種子液；(3)將種子液以體積百分濃度1％的接種量接種于自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48小時，將培養(yǎng)液超聲波破碎至鏡檢無細(xì)胞，離心后獲得上清，即為粗酶液；自誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為：阿拉伯糖3g/L，葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸鹽6.8g/L，硫酸鹽1.2g/L，NH4Cl2.65g/L，MgSO40.98g/L，CaCl20.1g/L，溶劑為水，pH值自然；(4)以緩沖液A先平衡蛋白質(zhì)Ni+柱后，加入步驟(3)制備的粗酶液，充分搖蕩30min，放掉廢液，以緩沖液A沖洗三次后，加入緩沖液B充分搖蕩均勻20min，后收集流出液，流出液中加入過量硫酸銨至無法溶解，離心3000rpm，10min，收集沉淀，沉淀中加入質(zhì)量濃度15％甘油水溶液溶解，獲得蛋白溶液；蛋白溶液過以g25為填料的層析柱脫鹽，檢測流出液的A280吸收值，收集A280吸收值大于0.1的部分，獲得純酶；緩沖液A：NaCl140mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO41.8mmol/L，以5MNaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0，溶劑為水；緩沖液B：NaH2PO4·2H2O50mM，NaCl300mM，咪唑(imidazole)500mM，以5M鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，溶劑為水。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)有益效果主要體現(xiàn)在：本專利技術(shù)亞油酸異構(gòu)酶突變體與野生型酶相比，催化亞油酸獲得反-10,順-12共軛亞油酸的酶活力得到了大大的提高，特別是雙突變時，如M62A/S295L，M62A/S295A，M62A/S295V，M62G/S295L，M62G/S295A，M62G/S295V，能夠提高10倍左右，具備良好的工業(yè)應(yīng)用前景。(四)附圖說明圖1為亞油酸異構(gòu)酶催化亞油酸獲得反-10,順-12共軛亞油酸的示意圖。圖2為純化后亞油酸異構(gòu)酶SDS-PAGE圖譜。(五)具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本專利技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本專利技術(shù)的保護(hù)范圍并不僅限于此：實施例1野生型亞油酸異構(gòu)酶(PAI；GeneBank號為AX062088)，但野生型亞油酸異構(gòu)酶的酶活力較低，不能很好地滿足工業(yè)應(yīng)用的要求。野生型亞油酸異構(gòu)酶氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，以含有該野生型亞油酸異構(gòu)酶基因(核苷酸序列如SEQIDNO：2所示)的PET28a重組質(zhì)粒(帶有組氨酸標(biāo)簽)為模板，在M62，S295位點進(jìn)行飽和突變。因此利用oligo7軟件設(shè)計平末端引物，后進(jìn)行PCR定點突變，引物如表1所示，其中M62-R和S295-R為反向引物，其余均為正向引物，其中每個位點的反向引物相同，正向引物中前三個堿基為突變位點。本次PCR突變采用KOD-Plus-NeoDNA聚合酶試劑盒(購買來自東洋紡本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種亞油酸異構(gòu)酶突變體，其特征在于所述突變體由氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示的亞油酸異構(gòu)酶第62位蛋氨酸突變?yōu)楸彼峄蚋拾彼?，?或第295位絲氨酸突變?yōu)楸彼?、亮氨酸或纈氨酸得到。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種亞油酸異構(gòu)酶突變體，其特征在于所述突變體由氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的亞油酸異構(gòu)酶第62位蛋氨酸突變?yōu)楸彼峄蚋拾彼幔?或第295位絲氨酸突變?yōu)楸彼?、亮氨酸或纈氨酸得到。2.如權(quán)利要求1所述亞油酸異構(gòu)酶突變體，其特征在于所述突變體是將第62位蛋氨酸突變?yōu)楸彼峄蚋拾彼?，同時第295位絲氨酸突變?yōu)楸彼?、亮氨酸或纈氨酸。3.如權(quán)利要求1所述亞油酸異構(gòu)酶突變體，其特征在于所述突變體的N端或C端連接有用于蛋白純化的組氨酸標(biāo)簽。4.一種權(quán)利要求1所述亞油酸異構(gòu)酶突變體的編碼基因。5.一種由權(quán)利要求4所述編碼基因構(gòu)建的重組載體。6.一種由權(quán)利要求5所述重組載體轉(zhuǎn)化制備的重組基因工程菌。7.一種權(quán)利要求1所述亞油酸異構(gòu)酶突變體在催化亞油酸制備(10E,12Z)-共軛亞油酸中的應(yīng)用。8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：以含亞油酸異構(gòu)酶突變體編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)液超聲破碎后提取的純酶為催化劑，以亞油酸為底物，以吐溫-80為助劑，于pH6.7、25mM磷酸緩沖液中，40℃水浴攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液分離純化，獲得(10E,12Z)-共軛亞油酸。9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述催化劑用量以緩沖液體積計為250～4000U/ml，所述底物用量以緩沖液體積計為50～150g/l，所述助劑體積用量以緩沖液體積計為5-15％。10.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備：(1)將含亞油酸異構(gòu)酶突變體編碼基因的重組基因工程菌...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳雪君，崔茂林，陳振明，周碩，賴敦岳，
申請(專利權(quán))人：杭州師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江,33