本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種在枯草芽孢桿菌中以非經(jīng)典分泌途徑進行分泌的異源蛋白及其在蛋白分泌表達中的應(yīng)用。來源于瘤胃菌Ruminococcus?sp.?5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶RDPE本身不帶有任何信號肽或分泌信號，卻可以大量分泌到胞外；通過實驗證明了RDPE并非通過Sec途徑或Tat途徑進行分泌，也不是因為細胞自溶和裂解而泄漏到胞外。因此，RDPE在枯草芽孢桿菌中是一種非經(jīng)典分泌蛋白。將RDPE分別與18種目標蛋白進行融合，嘗試以RDPE作為轉(zhuǎn)運信號實現(xiàn)目標蛋白的分泌表達，16種融合蛋白均在胞內(nèi)有明顯的表達，9種融合蛋白被成功分泌到胞外，其中2種融合蛋白的分泌水平占相應(yīng)融合蛋白總量的比例大于50%。所以，本實驗發(fā)展了一種實現(xiàn)蛋白質(zhì)在枯草芽孢桿菌中分泌表達的新策略。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種在枯草芽孢桿菌中通過非經(jīng)典分泌途徑進行分泌的異源蛋白，以及利用該蛋白作為轉(zhuǎn)運信號實現(xiàn)蛋白質(zhì)在枯草芽孢桿菌中分泌表達的一種新型策略。
技術(shù)介紹
枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）是工業(yè)生產(chǎn)中重要的蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌株。因為強大的蛋白質(zhì)分泌能力、安全菌種的定位（GRAS,generallyrecognizedassafe）、遺傳易操作性、無密碼子偏好性以及發(fā)酵成本低廉等特征，枯草芽孢桿菌吸引了眾多科學(xué)研究者的目光。在枯草芽孢桿菌中，大多數(shù)蛋白質(zhì)以未折疊狀態(tài)通過Sec途徑被轉(zhuǎn)運到胞外，少數(shù)蛋白（如PhoD和YwbN）以折疊狀態(tài)通過Tat途徑分泌到培養(yǎng)基中，還有一些蛋白通過ABC轉(zhuǎn)運子途徑、Com途徑和ESX途徑等方式進行分泌。目前，在蛋白分泌相關(guān)研究中，絕大多數(shù)蛋白是在經(jīng)典信號肽（Sec信號肽或Tat信號肽）的指導(dǎo)下分泌到胞外，但是大多蛋白質(zhì)的分泌效果往往并不理想。在經(jīng)典分泌途徑（Sec途徑和Tat途徑等）中的每一過程均可能成為限制蛋白質(zhì)分泌的因素。此外，一般情況下，細胞質(zhì)蛋白即使在信號肽的指導(dǎo)下也很難被分泌到細胞外的培養(yǎng)基中。以上因素限制了枯草芽孢桿菌在蛋白質(zhì)生產(chǎn)上的應(yīng)用。除了可通過上述已知分泌途徑分泌的蛋白，細菌中還存在一些不帶有任何信號肽及其它分泌信號的分泌型蛋白，這些蛋白的分泌機制尚不清楚，因此被稱為非經(jīng)典分泌蛋白。通過計算機軟件計算，枯草芽孢桿菌可以分泌大約300種蛋白質(zhì)。到目前為止，在枯草芽孢桿菌中，通過2D-電泳和質(zhì)譜技術(shù)已鑒定出113種分泌蛋白，其中84種含有經(jīng)典的信號肽（Sec信號肽和Tat信號肽）并在信號肽的指導(dǎo)下分泌到胞外；而其它分泌蛋白卻均不含有任何經(jīng)典的信號肽或分泌信號序列。Antelman等通過蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定出了17種可分泌到胞外的典型細胞質(zhì)蛋白（Antelmanetal.MicrobialProteomics:FunctionalBiologyofWholeOrganisms2006,JohnWiley&Sons,Inc.,Hoboken,NJ,USA）；Tjalsma等列舉了24種不帶有信號肽且可分泌到胞外的蛋白質(zhì)，并認為在細菌中不依賴信號肽的蛋白分泌現(xiàn)象可能比之前認為的更為普遍（Tjalsmaetal.Microbiol.Mol.Biol.Rev.2004,68:207）。Vitikainen等在枯草芽孢桿菌中對折疊酶PrsA進行結(jié)構(gòu)功能分析時發(fā)現(xiàn)了一些非經(jīng)典分泌蛋白，比如糖類代謝相關(guān)的蛋白Eno、PdhB、PdhD和CitH，目前尚不知這些蛋白在胞外是否具有功能（Vitikainenetal.JBiolChem2004,279:19302-19314）。Antelman等最初發(fā)現(xiàn)涉及氨基酸代謝的酶RocA和RocF是通過非經(jīng)典途徑分泌的（Antelmanetal.GenomeRes2001,11:1484-502），但是后來Vitikaimen證明只有RocF是非經(jīng)典分泌蛋白。Hirose等鑒定出具有運動性和趨藥性的蛋白Hag是存在胞外的（Hiroseetal.Microbiology2000,146:65-75），隨后同類蛋白FlgK和FliD也被鑒定位于胞外（Antelmanetal.GenomeRes2001,11:1484-502），這三種蛋白在胞外均具有已知功能。過氧化氫酶KatA缺少信號肽，因此開始被認為是一種胞內(nèi)酶，但是其后來被證明同樣可以分泌到胞外（占總蛋白的56%）（Naclerioetal.ApplEnvironMicrobiol1995,61:4471-4473）。此外，SodA、YceD、Ef-G和GroEL等蛋白也被不同研究人員在胞外檢測到。當(dāng)然，在胞外環(huán)境中檢測到非經(jīng)典分泌蛋白很容易被認為是細胞裂解而導(dǎo)致細胞質(zhì)蛋白發(fā)生泄漏的緣故。然而，Yang等人已證實一種異源的蛋白Est55和幾種不含有信號肽的自身細胞質(zhì)蛋白不是因為細胞裂解而泄漏到胞外，而是通過一種或某種未知的分泌途徑被轉(zhuǎn)運到胞外環(huán)境中（Yangetal.JournalofBacteriology2011,193:5607-5615）。事實上，眾多來自不同研究組關(guān)于不同菌種的研究已表明非經(jīng)典分泌蛋白在枯草芽孢桿菌中是真實存在的。盡管非經(jīng)典分泌的機制尚未清楚，但是研究人員已開始嘗試將非經(jīng)典分泌系統(tǒng)應(yīng)用到蛋白生產(chǎn)中。最近，Wang等人選擇了4種枯草芽孢桿菌自身非經(jīng)典分泌蛋白來嘗試引導(dǎo)異源蛋白分泌，結(jié)果4種蛋白均可以引導(dǎo)Nsp（Nucleoskeletallikeprotein）分泌到胞外，其中2種可以指導(dǎo)堿性磷酸酶PhoA的分泌，一種可以將耐高溫β-半乳糖苷酶BgaB轉(zhuǎn)運到胞外（Wangetal.MicrobCellFact2015,14:179）。盡管這些蛋白的分泌量大多很低，只能用Western-blotting的方法進行檢測，但是證明了非經(jīng)典分泌蛋白可以應(yīng)用在蛋白質(zhì)分泌表達中。因此，為了補充枯草芽孢桿菌的蛋白分泌途徑，以及拓展枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的使用范圍，更多的非經(jīng)典分泌蛋白需要被發(fā)掘并應(yīng)用到重組蛋白的生產(chǎn)中。本專利技術(shù)證明了來源于瘤胃菌Ruminococcussp.5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶RDPE是一種在枯草芽孢桿菌中的非經(jīng)典分泌蛋白，并以該非經(jīng)典分泌蛋白為分泌信號引導(dǎo)多個不同來源的目標蛋白實現(xiàn)了在枯草芽孢桿菌中的分泌表達。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的之一是證明來源于瘤胃菌Ruminococcussp.5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶RDPE是一種在枯草芽孢桿菌中可通過非經(jīng)典分泌途徑進行分泌的蛋白。所述的非經(jīng)典分泌途徑不是枯草芽孢桿菌中Sec途徑和Tat途徑等已知經(jīng)典分泌途徑，也不是因為細胞自溶和裂解而導(dǎo)致的胞內(nèi)蛋白泄漏的現(xiàn)象，而是一種未知的全新的蛋白分泌途徑。所述的異源蛋白RDPE的核酸序列如SEQIDNO.1所示，且其不含有經(jīng)典的信號肽和分泌信號序列。所述的枯草芽孢桿菌可以是枯草芽孢桿菌168、WB600、WB700、WB800、1A751、DB104或以上菌株后代細胞中的一種。本專利技術(shù)的目的之二是提供一種利用非經(jīng)典分泌蛋白RDPE并通過非經(jīng)典分泌途徑實現(xiàn)蛋白分泌表達的方法，即非經(jīng)典分泌蛋白RDPE在蛋白分泌表達中的應(yīng)用，是將RDPE與候選目標蛋白進行融合并構(gòu)建一系列重組表達質(zhì)粒pMA5-RDPE-TP，分別轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌菌株后進行篩選培養(yǎng)，多達50%的目標蛋白可成功分泌到胞外。所述的重組表達質(zhì)粒pMA5-RDPE-TP包含非經(jīng)典分泌蛋白RDPE的編碼本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種在枯草芽孢桿菌中可通過非經(jīng)典分泌途徑進行分泌的異源蛋白RDPE，其特征在于，其是來源于瘤胃菌Ruminococcus?sp.?5_1_39B_FAA的D?阿洛酮糖?3?差向異構(gòu)酶。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種在枯草芽孢桿菌中可通過非經(jīng)典分泌途徑進行分泌的異源蛋白RDPE，其特征在
于，其是來源于瘤胃菌Ruminococcussp.5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非經(jīng)典分泌途徑，其特征在于，其并非枯草芽孢桿菌中Sec分
泌途徑和Tat分泌途徑等已知經(jīng)典途徑，也不是因為細胞自溶和裂解而導(dǎo)致的胞內(nèi)蛋白泄
漏現(xiàn)象，而是一種未知的全新的蛋白分泌途徑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異源蛋白RDPE，其特征在于，其核酸序列如SEQIDNO.1所示
且不含有任何經(jīng)典的信號肽和分泌信號序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于，其是枯草芽孢桿菌168、
WB600、WB700、WB800、1A751、DB104或以上菌株后代細胞中的一種。
5.一種利用權(quán)利要求1所述異源蛋白RDPE并通過權(quán)利要求1和2所述非經(jīng)典分泌途徑實
現(xiàn)蛋白分泌表達的方法，即非經(jīng)典分泌蛋白RDPE在蛋白分泌表達中的應(yīng)用，其特征在于，將
RDPE與候選目標蛋白進行融合并構(gòu)建一系列重組表達質(zhì)粒pMA5-RDPE-TP，分別轉(zhuǎn)化到枯草
芽孢桿菌菌株后進行篩選培養(yǎng)，多達50%的融合蛋白成功分泌到胞外。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達質(zhì)粒pMA5-RDPE-TP，其特征在于，其包含非經(jīng)典分泌
蛋白RDPE的編碼序列、21-bp的柔性Linker序列和目標蛋白的編碼序列融合而獲得的DNA序
列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組表達質(zhì)粒pMA5-RDPE-TP，其特征在于，其中的21-bp的柔
性Linker序列為5’-GGTAGCGGTGGAGGTGGCAGC-3’。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組表達質(zhì)粒pMA5-RDPE-TP，其特征在于，其中的目標蛋白分
別為枯草芽孢桿菌來源的GroES、GroEL、DnaK、DnaJ、XylA、Pel、PhoA(BS)、LipA、PhoD、YwbN
和PrsA，其它細菌來源的LacZ、PhoA(EC)、BgaB、AmyS和AmyL以及真核生物來源的GFP和RFP。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組表達質(zhì)粒pMA5-RDPE-TP，其特征在于，該質(zhì)粒還包含組成
型強啟動子PHpaII。
10.根據(jù)權(quán)利要求...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張大偉，陳景奇，趙留群，孫際賓，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：天津;12
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