本發明專利技術提供了一種源自壤霉菌（Agromyces?sp.）的鹵醇脫鹵酶、編碼基因及載體，以及其在制備環氧氯丙烷和(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯中的應用。該鹵醇脫鹵酶氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，其編碼基因序列如如SEQ?ID?NO.1所示。本發明專利技術的有益效果主要體現在：提供了一種來源于壤霉菌（Agromyces?sp.）CCTCC?No：M?2012299的鹵醇脫鹵酶及其編碼基因；該鹵醇脫鹵酶基因可與表達載體連接構建得到含該基因的表達重組質粒pET28b-Deh，再轉化至大腸桿菌BL21中，獲得再分別對應轉化至大腸桿菌菌株中，獲得重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌含有鹵醇脫鹵酶，可以利用重組大腸桿菌為酶源進行生物轉化與催化。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種鹵醇脫鹵酶、編碼基因及載體，產鹵醇脫鹵酶的新菌株，以及其在制備環氧氯丙烷和(R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯中的應用。
技術介紹
鹵醇脫鹵酶，也叫鹵醇-鹵化氫裂解酶，通過分子內親核取代機制催化芳香族或者脂肪族鄰鹵醇轉化為環氧化物和鹵化氫，是微生物降解有機鹵化合物的關鍵酶之一。根據其序列同源性分為HheA、HheB、HheC 3類。有機鹵化合物已成為當今重要環境污染物之一，主要是由于排廢以及人工合成鹵化物的廣泛應用造成的。在自然界中，大部分異生質鹵化物自降解能力很差，同時許多化合物被疑是致癌或高誘變物質。因此，應用微生物和脫鹵酶降解有機鹵化物已引起人們廣泛的關注，在環境污染治理，特別是手性環氧化物合成方面等具有十分重要的作用。鹵醇脫鹵酶主要通過蛋白結構中保守的絲氨酸與底物羥基氧原子之間形成氫鍵， 穩定與底物結合，通過精氨酸降低絡氨酸的PKa值，酪氨酸從底物上的氧原子作為親核試劑，進攻鄰位鹵素取代的碳原子，進而釋放鹵離子，形成環氧化物。鹵醇脫鹵酶不但可以催化碳-鹵鍵的斷裂進行脫鹵反應，可以高選擇性地催化接受除了鹵離子以外的一系列非自然親核試劑，如N3_、NO2' CN—等所介導的環氧化物開環反應，用以生成一系列光學純的 β_取代醇。因此可以用來合成一些非自然手性化合物。鹵醇脫鹵酶可以廣泛應用于環氧化物以及取代醇。其中疊氮化醇、氰取代醇以及硝基醇是合成氨基醇的前體；手性氨基醇在生物制藥領域是一類很重要的化合物，可用來合成多種生物活性物質。異硫氰酸取代醇和噁唑烷酮在農用化學試劑、醫藥和高分子化學領域中有著廣泛應用。近年，已從多種微生物中發現了齒醇脫齒酶，如Agrobacterium radiobacter ADl，Agrobacter sp. AD2，Corynebacterium sp. N—1074，Agrobacterium tumefaciens， Arthrobacter erithii HlOa, Alcaligenes sp. DS—K—S38 ， Pseudomonas sp. DS_k_2DI 等。部分鹵醇脫鹵酶的基因已被克隆并在大腸桿菌中表達，獲得產酶活力較高的基因工程菌，并應用于催化形成環氧化合物及β-取代醇。但是對已有鹵醇脫鹵酶進行研究的同時， 挖掘新的的微生物來源的鹵醇脫鹵酶基因仍是今后研究的熱點。
技術實現思路
本專利技術目的是提供一種源自壤霉菌(Agromyces sp.)的鹵醇脫鹵酶、編碼基因及載體，以及其在制備環氧氯丙烷和(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯中的應用。本專利技術采用的技術方案是一種鹵醇脫鹵酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本專利技術還涉及編碼所述鹵醇脫鹵酶的基因。所述基因的核苷酸如SEQ ID NO :1所/Jn ο該鹵醇脫鹵酶基因由如下方法得到利用硫酸銨沉淀和離子交換等分離純化手段從壤霉菌(Agromyces sp. ) CCTCC NO M 2012299菌株中分離純化得到脫鹵酶蛋白，經過N 端序列測序和肽指紋圖譜分析，發現該酶與Arthrobacter sp. AD2和Corynebacterium sp. N-1074的Haloalcohol Dehalogenase HheA存在同源性，以此設計引物。利用PCR 技術，在引物 I (ATGMGNATCGCCCTCGTGACTC)、引物 2 (TTAGGGCAGATAGCC ACCG)的作用下以來源于壤霉菌(Agromyces sp. ) CCTCC NO M 2012299菌株中的總基因組DNA為模板克隆長約O. 75kb的鹵醇脫鹵酶基因片段。將該片段連接到PMD18-T載體上獲得克隆載體 pMD18-T-Deh和轉化了 pMD18-T_Deh的重組大腸桿菌。對重組質粒測序，并利用軟件對測序結果進行分析，該序列含有一個長為735bp的開放閱讀框。該基因核苷酸序列為(SEQ ID NO. I)IATGCGCATCGCCCTCGTGACTCATGCACGGCATTTTGCAGGCCCCGCCGCCGTCGAGGCG61CTTACGCGGGATGGCTATACCGTGGTTTGCCACGACGCGAGCTTCGCTGATGCAGCTGM121CGACAGCGTTTCGAGTCGGAGMCCCGGGCACCATCGCGCTCGCCGAGCAGMGCCCGAG181CGTCTGGTCGACGCCACGCTGCAGTACGGGGMGCGATCGACACGATCGTCTCGMCGAT241TACATTCCGCGCCCGATGMTCGGCTCCCGATCGAGGGMCGAGCGAGGCCGACATCCGA301CAGATGTTCGAGGCGCTCAGCATCTTCCCGATCCTGCTCCTGCAGTCGGCCATCGCGCCG361CTACGGGCTGCAGGCGGCGCCTCCGTTATCTTCATCACGTCCTCGGTTGGCMGMGCCG421CTCGCCTACAACCCTCTCTATGGGCCCGCGCGCGCCGCTACCGTCGCGCTTGTCGMTCG481GCAGCGMGACGCTGTCCCGTGACGGMTCTTGCTCTATGCGATCGGTCCGMCTTCTTC541MCMCCCGACGTACTTCCCGACGTCGGATTGGGAGMCGACCCCGAGCTCCGGGATCGT601GTCGAGCGGGACGTGCCGCTCGGTCGCCTCGGCCGTCCGGACGAGATGGGTGCGCTGATC 661 721ACCTTCCTCG GGCTATCTGCCTTCGCGTCG CCTAATGCAGCGCCCATCGTGGGGCAGTTCTTCGCTTTCACCGGT 利用軟件對該基因序列進行分析，推知所述鹵醇脫鹵酶基因編碼SEQ 示的氨基酸序列ID NO. 2 所IMRIALVTHARHFAGPMVEALTRDGYTVVCHDASFADMERQRFESENPGTIALAEQKPE61RLVDATLQYGEAIDTIVSNDYIPRPMNRLPIEGTSEADIRQMFEALSIFPILLLQSAIAP121LRMGGASVIFITSSVGKKPLAYNPLYGPARMTVALVESMKTLSRDGILLYAIGPNFF 181 241NNPTYFPTSD GYLPWENDPELRDRVERDVPLGRLGRPDEMGALITFLASRRMPIVGQFFAFTG本專利技術所述基因源自壤霉菌(Agromycessp. ) CCTCC No M 2012299。本專利技術還涉及一株產鹵醇脫鹵酶的新菌株-壤霉菌(Agromyces sp.)ZJB120203，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵編430072，保藏編號CCTCC No M 2012299，保藏日期2012年7月25日。本專利技術還涉及一種含有所述鹵醇脫鹵酶基因的重組載體，以及利用該重組載體轉化獲得的基因工程菌。本專利技術還涉及所述的基因在制備重組鹵醇脫鹵酶中的應用。本申請專利技術人根據測序結果設計胞內表達引物3 (CGCCATATGCGC ATCGCCCTCGTGACT C)和弓丨物 4 (CCGC本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種鹵醇脫鹵酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
【技術特征摘要】
1.一種鹵醇脫鹵酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。2.編碼權利要求I所述鹵醇脫鹵酶的基因。3.如權利要求2所述的基因，特征在于所述基因的核苷酸如SEQID NO. I所示。4.如權利要求2所述的基因，特征在于所述基因源自壤霉菌(Agromycessp. ) CCTCCNo M 2012299。5.壤霉菌(Agromycessp. ) ZJB120203，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵編430072，保藏編號CCTCC No M 2012299，保藏日期2012年7月25日。6.一...
【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭裕國，薛鋒，柳志強，萬南微，高愛存，沈寅初，
申請(專利權)人：浙江工業大學，
類型：發明
國別省市：
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