本發明專利技術提供了一種突變型頭孢菌素C酰化酶，將具有序列表中SEQ?ID?NO.1的氨基酸序列進行一個或多個氨基酸位點取代得到的突變氨基酸序列；氨基酸取代位點為288位的纈氨酸、296位的組氨酸和417位的組氨酸中的一個或多個。解決了現有技術中突變型頭孢菌素C酰化酶催化活性小，酶活性受外界影響大，存在產物抑制的技術問題。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物工程領域，特別地，涉及一種突變型頭孢菌素C酰化酶，本專利技術的另一方面還提供了前述突變型頭孢菌素C酰化酶的制備方法和應用。
技術介紹
7_氨基頭抱燒酸(7-aminocephalosporanic acid, 7-ACA)是醫藥工業生產半合成頭孢菌素抗生素的重要中間體，工業化生產7-ACA主要用化學法和酶法。目前國內7-ACA 生產大多仍采用化學法，但由于該方法需采用大量昂貴的化學試劑、反應條件苛刻、環境污染嚴重、成本高等缺陷，而酶法生產7-ACA優勢明顯，工藝簡單、反應條件溫和、生產環保、 成本低、質量優等特點。化學法技術成熟，進一步上升的空間較小；而酶法技術先進，綠色環保，仍具備較大上升空間。隨著國家環保的重視、及對可持續發展的綠色工業追求，酶法取代化學法是必然的趨勢。酶法生產7-ACA可分為兩步酶法和一步酶法。目前主要研究及工業化應用的是兩步酶法，其過程主要是頭孢菌素C鈉鹽在固定化D-氨基酸氧化酶催化下被氧化成α -酮己二酸單酰7-ACA，α -酮己二酸單酰7-ACA迅速轉化為GL-7-ACA，GL-7-ACA在固定化 GL-7-ACA酰化酶催化作用下裂解為7-ACA和戊二酸，再經過結晶和干燥得到7-ACA產品。一步酶法是利用頭孢菌素C酰化酶對底物CPC進行直接催化生成7-ACA，相比于兩步酶法，一步酶法具有生產工藝簡單、設備要求低及生產成本低等優點，但是頭孢菌素C酰化酶對CPC 的催化活性低，僅為GL-7-ACA酰化酶的2 4%。為了提高頭孢菌素C酰化酶的催化活性，目前對頭孢菌素C酰化酶進行突變的方式主要有以下幾個1、取頭孢菌素酰化酶基因序列，在270位點引入苯丙氨酸，在215、296、 416、417、261、271、294、297、307、308和309等位點引入突變氨基酸，經密碼子優化后克隆入ρΕΤ24，轉化入大腸桿菌BL21 (DE3)獲得含有頭孢菌素酰化酶突變基因的轉化子，發酵檢測發現在這些位點的突變提高了頭孢菌素酰化酶的CPC酰化酶活性。2、將來源于假單胞桿菌Ν176中頭孢菌素C酰基轉移酶基因(vac)序列，設計出兩條適用于頂頭孢霉中表達的基因序列(ecsl和ecs2)，利用基因工程技術轉化入頂頭孢霉獲得包含有ecsl或ecs2的轉化子，在轉化子發酵液中檢測到7-ACA轉化率為38. 4%。3、、基于來源于假單胞桿菌SE83的 CPC酰化酶基因(acy II)序列，通過分子模擬技術進行理性設計，應用定點突變和飽和突變技術對V121a、G139a、F58 0、175 β、1176 β和S471 β等六個點進行突變，密碼子優化后轉化入大腸桿菌得到轉化子后檢測突變效果，V121 a A、G139 a S、F58 β N、175 β Τ、1176 β V 和S471 β C等六倍突變體S12的CPC酰化酶活性最高，高達712U/L，對CPC的轉化率也高達 98%。3、基于假單胞桿菌SE83的CPC酰化酶基因(acy II )氨基酸序列，在引入S12的6個突變點的基礎上進行了 L677F和A675G雙點突變得到突變體CAase_TU2，經密碼子優化后克隆入pET28a(+)和pMKC載體，分別轉化入BL21 (DE3)和JM105后誘導表達出CPC酰化酶。 4、基于假單胞桿菌SE83頭孢菌素酰化酶II基因(acy II )序列，通過密碼子優化技術，降低基因序列中的GC含量，獲得合成CPC酰化酶基因(sCPCAcy)，其CPC酰化活力高于GL-7-ACA 酰化活力2. 3倍，基于sCPCAcy基因序列，把位于通道處675位點的Ala突變成Gly，克隆入pET28后轉入大腸桿菌JM109 (DE3)獲得大腸桿菌JM109 (DE3) /pET28_sCPCAcyA675G表達系統，誘導表達后得到CPC酰化酶。前述這些突變方法雖然酶活力有所提高，但是仍然無法滿足工業需求，同時得到的突變型頭孢菌素C酰化酶容易受7-ACA產物的抑制，使7-ACA 的產率低，轉化速率低，酶的活性受外界影響較大。為了滿足工業的需求，急需要一種酶活力高，不易受產物抑制，受外界因素影響較小的頭孢菌素C酰化酶。
技術實現思路
本專利技術目的在于提供一種突變型頭孢菌素C酰化酶及其制備方法和應用，以解決現有技術中突變型頭孢菌素C酰化酶催化活性小，酶活性受外界影響大，存在產物抑制的技術問題。為實現上述目的，根據本專利技術的一個方面，提供了一種突變型頭孢菌素C酰化酶， 將具有序列表中SEQ ID NO. I的氨基酸序列進行一個或多個氨基酸位點取代得到的突變氨基酸序列；氨基酸取代位點為288位的纈氨酸、296位的組氨酸和417位的組氨酸中的一個或多個。進一步地，突變氨基酸序列的編碼基因為a'中的一種，a)具有序列表中SEQ ID NO. 4的基因序列；b)具有序列表中SEQ ID NO. 6的基因序列；c)具有序列表中SEQ ID NO. 8的基因序列；d)在嚴格條件下可與a、b或c任一項限定的基因序列雜交且編碼具有頭孢菌素C 酰化酶活性的蛋白質的基因序列；e)與a、b或c任一項限定的基因序列具有90%以上的同源性且編碼具有頭孢菌素C酰化酶活性的蛋白質的基因序列。進一步地，突變氨基酸序列為將第288位的纈氨酸突變為甲硫氨酸，具有序列表中SEQ IDN0. 3的氨基酸序列ο進一步地，突變氨基酸序列為將第288位的纈氨酸突變為甲硫氨酸，將第417位的組氨酸突變為甘氨酸，具有序列表中SEQ ID NO. 5的氨基酸序列。進一步地，突變氨基酸序列為將第288位的纈氨酸突變為甲硫氨酸，將第296位的組氨酸突變為天然氨基酸和將第417位的組氨酸突變為甘氨酸。進一步地，第296位的組氨酸為突變為苯丙氨酸，具有序列表中SEQ ID NO. 7的蛋白質序列。本專利技術的另一方面還提供了一種前述突變型頭孢菌素C酰化酶的制備方法，包括以下步驟a)將具有序列表中SEQ ID NO. 2的基因序列進行定點突變、定點飽和突變或多點突變步驟得到可編碼SEQ ID NO. I氨基酸序列的突變基因；b)將突變基因插入到質粒中得到表達載體；c)將表達載體轉化進入菌株中得到重組菌；d)將重組菌用1%乳糖誘導進行發酵得到頭孢菌素C酰化酶。進一步地，還包括純化步驟，純化步驟為將頭孢菌素C酰化酶通過固定化金屬親和層析法進行純化得到頭孢菌素C酰化酶純酶。進一步地，質粒為pET28a(+)，菌株為 E. coli BL21(DE3)。本專利技術的另一方面還提供了一種由前述頭孢菌素C酰化酶轉化成7-ACA的方法， 將前述述頭孢菌素C酰化酶與CPC-Na底物進行轉化反應f 3h，轉化溫度為2(T25°C，pH為 8. 2 8. 6。本專利技術具有以下有益效果本專利技術提供的突變型頭孢菌素C酰化酶，通過對野生型頭孢菌素C酰化酶的第288 位的纈氨酸進行突變可以增加頭孢菌素C酰化酶穩定性，對第417位組氨酸位點進行突變， 可以減小組氨酸活性作用區域的空間位阻，對第296為組氨酸位點進行突變可以改變活性作用區域的酸堿性和空間位阻，通過對前述三個位點的突變改變了野生型頭孢菌素C酰化酶的生物性能，提高了催化活性高和比活，同時產物對突變型頭孢菌素C酰化酶抑制小，受外界影響小，可以迅速的催化CPC轉化生本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種突變型頭孢菌素C酰化酶，其特征在于，將具有序列表中SEQ?ID?NO.1所述的氨基酸序列進行一個或多個氨基酸位點取代得到的突變氨基酸序列；所述氨基酸取代位點為288位的纈氨酸、296位的組氨酸和417位的組氨酸中的一個或多個。
【技術特征摘要】
1.一種突變型頭孢菌素C酰化酶，其特征在于，將具有序列表中SEQ ID NO. I所述的氨基酸序列進行一個或多個氨基酸位點取代得到的突變氨基酸序列；所述氨基酸取代位點為288位的纈氨酸、296位的組氨酸和417位的組氨酸中的一個或多個。2.根據權利要求I所述的突變型頭孢菌素C酰化酶，其特征在于，所述突變氨基酸序列的編碼基因為a e中的一種， a)具有序列表中SEQID NO. 4所述的基因序列； b)具有序列表中SEQID NO. 6所述的基因序列； c)具有序列表中SEQID NO. 8所述的基因序列； d)在嚴格條件下可與所述a、b或c任一項限定的基因序列雜交且編碼具有頭孢菌素C酰化酶活性的蛋白質的基因序列； e)與所述a、b或c任一項限定的基因序列具有90%以上的同源性且編碼具有頭孢菌素C酰化酶活性的蛋白質的基因序列。3.根據權利要求I所述的突變型頭孢菌素C酰化酶，其特征在于，所述突變氨基酸序列為將所述第288位的纈氨酸突變為甲硫氨酸，具有序列表中SEQ ID NO. 3所述的氨基酸序列。4.根據權利要求I所述的突變型頭孢菌素C酰化酶，其特征在于，所述突變氨基酸序列為將所述第288位的纈氨酸突變為甲硫氨酸，將所述第417位的組氨酸突變為甘氨酸，具有序列表中SEQ ID NO. 5所述的氨基酸序列。5.根據權利要求I所述的突變型頭孢菌素C酰化酶，其特征在于...
【專利技術屬性】
技術研發人員：許崗，黃斌，曾紅宇，
申請(專利權)人：湖南福來格生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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