本發明專利技術公開了一種淀粉脫支酶的發酵生產工藝，屬于發酵工程技術領域。本發明專利技術采用重組大腸桿菌E.coLi?BL21(DE3)為生產菌株，在工業級發酵培養基中連續流加甘油進行分批補料發酵，在發酵過程中添加甜菜堿，對數生長中期流加乳糖進行誘導，發酵后期添加Tween80促進酶的分泌，淀粉脫支酶酶活達到1400U/mL。采取本策略進行發酵實現了淀粉脫支酶的高效可溶性表達，大幅提高了脫支酶的生產強度。本工藝采用工業上常用的甘油、蛋白胨、酵母粉等原料進行生產，簡單易行，適于大規模生產。
【技術實現步驟摘要】
一種重組淀粉脫支酶發酵生產工藝
本專利技術屬于酶發酵工程
，本專利技術涉及一種重組淀粉脫支酶高效可溶性表達的發酵生產方法。
技術介紹
淀粉脫支酶(E. C. 3. 2. I. 41)是一類能夠水解支鏈淀粉、α _極限糊精等分子中 α -1，6葡萄糖苷鍵的淀粉水解酶。淀粉脫支酶通常和其它淀粉酶復配用于生產葡萄糖、果糖、麥芽糖、麥芽糊精、低聚糖等產品。淀粉脫支酶可以切斷淀粉中的分支點，加速后續酶的反應，縮短反應時間，提高淀粉的轉化率，降低其它糖化用酶制劑的使用量，從而達到增加產量、提高設備利用率、降低生產成本的目的。目前能夠在最適溫度和最適PH上同時實現與糖化酶進行較好配合的商品化淀粉脫支酶主要是美國杰能科公司的OptimaxL-lOOO。我國雖然對淀粉脫支酶進行了大量的研究，但是還沒有實現該酶的工業化生產，還需要依賴進口。近年來國內外學者把淀粉脫支酶的開發研究作為非常重要的研究主題。Bunzo Mikami等對來源于Klebsiella pneumoniae的淀粉脫支酶蛋白晶體結構進行解析,發現該酶具有GH13淀粉水解酶家族共有的(β/α)8桶狀結構。近年來國外學者從極端嗜熱微生物中分離出具有可以耐受接近100°C高溫的淀粉脫支酶，但是這些酶往往只有在pH 6.0以上才具有較高的活性。R Koch等從Fervidobacterium pennavorans中分離到最適pH在4. 5 到5. 0，而且能夠在70°C條件下具有較高穩定性的淀粉脫支酶。我國對淀粉脫支酶的研究雖晚于國外，但也有30多年的歷史。早期工作主要圍繞菌株的篩選。至上世紀90年代，我國市場上開始出售進口淀粉脫支酶，繼而引發了對淀粉脫支酶在淀粉加工中的應用研究，并逐步推廣到淀粉糖、釀造及其它發酵行業，帶動了相關產業的技術提升。至2000年前后隨著我國淀粉加工行業的快速發展，對淀粉脫支酶的需求激增，淀粉脫支酶生產菌株的開發逐漸升溫。目前，我國科研人員先后在Bacillus、Thermotoga等微生物中篩選到一些性能優良的酶種，并開展了野生菌的誘變育種、酶的重組表達及發酵條件優化。唐寶英等人從土壤中分離出一株產淀粉脫支酶芽孢桿菌，通過誘變和產酶條件優化，酶活從I. 6U/mL提高到8. 8U/mL，該酶最適反應溫度和pH分別為75°C和4. 6，在55°C反應條件下，在pH4. 0-8. O 范圍內活性穩定。張明炎等將來源于地衣芽孢桿菌的淀粉脫支酶編碼基因克隆大腸桿菌中進行表達，搖瓶發酵產酶最高達到6. 5U/mL。蘇品等實現了來源于Thermotoga maritima 的淀粉脫支酶編碼基因在枯草芽孢桿菌中的成功表達，該酶最適溫度90°C，最適pH 6.0， 發酵酶活可達89. lU/mL。但是這些菌株的產酶水平仍然較低，生產成本高。2005年云南師范大學楊元娟等將B. naganoensis淀粉脫支酶克隆到P. pastoris中表達,酶產量可達到 350. 8U/mL。我們以重組大腸桿菌pulB/pET20b (+) /BL21 (DE3)為生產菌株，在工業級發酵培養基中連續流加甘油進行分批補料發酵，發酵后期通過添加Tween 80來促進活性蛋白聚集體解聚提高酶的分泌，發酵35小時，胞外酶活可達386U/mL (吳敬，陳晟，段緒果，陳堅 一種通過促進活性蛋白聚集體解聚提高淀粉脫支酶產量的方法.CN 201210035298.0)。除3了少數報道外，大多數的表達水平仍然較低。綜上所述，大多數微生物來源的淀粉脫支酶屬于胞外酶，由于野生菌產酶能力較低，研究者大多嘗試采用大腸桿菌或枯草桿菌表達系統分泌重組酶。然而，重組淀粉脫支酶由于自身性質決定了其極易活性蛋白聚集體，導致可溶性表達水平很低。因此有必要對發酵工藝進行改進來進一步提高淀粉脫支酶的表達及分泌水平，繼續降低其生產成本低。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種通過增加淀粉脫支酶可溶性水平來提高淀粉脫支酶產量的方法，以解決現有發酵工藝中胞外酶活較低、生產成本高的問題。為解決上述問題，本專利技術的技術方案如下一種重組淀粉脫支酶發酵生產工藝，以重組大腸桿菌是pulB/pET20b(+)/ BL21(DE3)為生產菌種(一種通過促進活性蛋白聚集體解聚提高淀粉脫支酶產量的方法· CN 201210035298. O)，具體過程如下(I)種子制備將_80°C甘油管保存的菌株接入種子培養基中，使用回轉恒溫調速搖床進行培養，控制轉速200rpm/min，培養溫度37°C，初始pH值7. 10，培養時間8_10小時。(2)發酵工藝將種子培養液接種入發酵培養基中，通過控制攪拌轉速和通風量使溶氧維持20-30 %，控制溫度為30 ± I °C，流加質量濃度為25 %的氨水控制pH 7. O ± O. 5， 培養5-6小時，待溶氧上升至80-100%，以指數流加的方式補加補料液并調節轉速及通風使溶氧維持在20-30%，發酵培養28-32小時。(3)甘油補料發酵培養進行到4-5小后,通過補加500g/L的甘油補料液,使發酵液中甘油濃度維持在2_5g/L ；(4)添加甜菜堿發酵過程中，采用一次性添加，分批添加或者流加方式，加入 5-200mmol/L的甜菜堿(發酵罐中的終濃度)。(5)甘氨酸補料發酵培養6-7小時(OD6tltl為15_30)后,米用一次性添加的方式， 加入O. 5% -I. 5%甘氨酸(質量分數)。(6)乳糖誘導發酵培養8-9小時，菌體吸光度OD6tltl達到45_60時，降溫至 23-300C，通過補加濃度為200g/L乳糖溶液，使發酵液中乳糖殘留濃度控制在4_6g/L。誘導 15小時左右，添加O. 1-1. 0%濃度的Tween 80，繼續發酵1-10小時。所述種子培養基的組成為工業級蛋白胨10g/L，工業級酵母粉5g/L，NaCL IOg/ L，pH 7. 10，種子培養基還可以添加100mg/L氨芐青霉素。所述發酵培養基的組成為甘油6g/L，工業級蛋白胨12g/L，工業級酵母粉24g/L， KH2P042. 31g/L，K2HP043H20 16. 43g/L，微量元素液 10mL/L，發酵培養基還可以添加 100mg/L氨芐青霉素。所述微量元素液為=FeSO4· 7H20 10g/L，ZnSO4 · 7H20 2. 25g/L，CuSO4 · 5H20 I. Og/ L, MnSO4 · 4H20 0. 5g/L, Na2B4O7 · IOH20,0. 23g/L, CaCl22. Og/L, (NH4)6Mo7O24O. lg/L。所述補料液為甘油500g/L，MgSO4 · 7H20 20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L。所述甘油補料液質量分數為50% (500g/L);甘油含量的測定方法采用HPLC : Zorbax Extend_C18 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m),柱溫 35°C，進樣量10 μ L,差不折光檢測器溫度35°C,流速1. OmL/min，流動相純水；發酵培養4小時后，每隔I小時,對發酵液中甘油濃度進行一次測定，根據測定結果加入一定體積的補料液，使發酵液中甘油濃度維持在 2-5g/L。所述發酵液中乳糖濃度的測定方法參見GB/本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種淀粉脫支酶的發酵生產方法，其特征在于以含有重組淀粉脫支酶編碼基因的大腸桿菌為生產菌株，發酵工藝如下：將活化后的種子培養液接入發酵培養基中，通過控制攪拌轉速和通風量使溶氧維持20?30％，控制溫度為25?37℃，流加氨水控制pH?7.0±0.5，培養5?6小時；待溶氧上升至80?100％，以指數流加的方式補加補料液使溶氧維持在20?30％，溫度維持在25?37℃，流加氨水控制pH?7.0±0.5，在發酵過程中添加適量的甜菜堿，當菌體OD600達到15?30時補加0.75?1.5％(m/V)的甘氨酸；繼續培養至菌體吸光度OD600達到45?60時，通過補加乳糖溶液，使發酵液剩余乳糖濃度控制在4?6g/L；同時溶氧控制在20?30％，控制pH?7.0±0.5，誘導5?20小時，添加吐溫80后再繼續發酵1?10小時。
【技術特征摘要】
1.一種淀粉脫支酶的發酵生產方法，其特征在于以含有重組淀粉脫支酶編碼基因的大腸桿菌為生產菌株，發酵工藝如下 將活化后的種子培養液接入發酵培養基中，通過控制攪拌轉速和通風量使溶氧維持20-30%，控制溫度為25-37 °C，流加氨水控制pH 7. 0±0. 5，培養5_6小時； 待溶氧上升至80-100%，以指數流加的方式補加補料液使溶氧維持在20-30%，溫度維持在25-37°C，流加氨水控制pH 7. 0±0. 5，在發酵過程中添加適量的甜菜堿，當菌體OD600達到15-30時補加0. 75-1. 5% (m/V)的甘氨酸； 繼續培養至菌體吸光度0D_達到45-60時，通過補加乳糖溶液，使發酵液剩余乳糖濃度控制在4-6g/L ;同時溶氧控制在20-30%，控制pH 7. 0±0. 5，誘導5_20小時，添加吐溫80后再繼續發酵1-10小時。2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述甜菜堿的添加量為5-200mmol/...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳敬，段緒果，陳晟，陳堅，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：
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