定性檢測(cè)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1基因分型的測(cè)序引物對(duì)及其試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種定性檢測(cè)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1基因分型的測(cè)序引物對(duì)及其試劑盒，屬于體外核酸檢測(cè)領(lǐng)域，所述試劑盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR反應(yīng)液、PCR擴(kuò)增引物、焦磷酸測(cè)序引物、以及陽(yáng)性對(duì)照品；本發(fā)明專利技術(shù)提供的試劑盒靈敏度高，特異性好，PCR產(chǎn)物簡(jiǎn)單處理即可上焦磷酸測(cè)序儀測(cè)序，操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)時(shí)間短，比金標(biāo)準(zhǔn)——毛細(xì)管電泳測(cè)序靈敏度高，更適合用于突變分析。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及體外核酸檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種在臨床樣本中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶IAl (UGTlAl)基因分型的測(cè)序引物對(duì)及其試劑盒。
技術(shù)介紹
尿苷二憐酸葡萄糖醒酸基轉(zhuǎn)移酶(uridinediphosphoglucuronateglucucronosy I transferase, UGT)是生物體內(nèi)進(jìn)行第II相生物轉(zhuǎn)化時(shí)最重要的酶之一，屬于糖基轉(zhuǎn)移酶超家族。UGT共有2個(gè)亞家族，UGTlA和UGT2家族。UGTlAl是一種對(duì)許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)進(jìn)行解毒，加強(qiáng)其排泄的重要酶類，UGTlAl基因的遺傳多態(tài)性對(duì)減輕藥物的毒副作用有重要的臨床意義。目前發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性主要包括(TA) η重復(fù)序列啟動(dòng)子(UGT1A1*28)的多態(tài)性和UGT1A1*6基因序列的多態(tài)性。在中國(guó)人中，UGT1A1*28只發(fā)現(xiàn)兩種類型(TA)6和(TA)7，可組合成TA6/6、TA6/7和TA7/7三種等位基因。相對(duì)于TA6/6表·型患者，TA7/7表型患者的UGTlAl酶活性降低約50%。UGT1A1*6基因突變主要發(fā)生在第一號(hào)外顯子第211核苷酸上G突變成A，導(dǎo)致其編碼的甘氨酸變?yōu)榫彼?G71R)。UGTlAl基因表達(dá)減少會(huì)增加人體對(duì)某些藥物的敏感性，可能發(fā)生未預(yù)期的毒性。伊立替康(Irinotecan，CPT-11)，是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑，可誘導(dǎo)單鏈DNA損傷，從而阻斷DNA復(fù)制叉，阻止DNA鏈的重新組裝，引起DNA雙鏈的斷裂，造成細(xì)胞死亡。主要治療成人晚期轉(zhuǎn)移性大腸癌，對(duì)小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌和卵巢癌亦有療效。伊立替康為前體藥物，在體內(nèi)經(jīng)過羧酸酯酶轉(zhuǎn)化為活性代謝物。羧酸酯酶將伊立替康分子10位的哌啶側(cè)鏈裂解，產(chǎn)生7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)，其活性較伊立替康強(qiáng)100到1000倍。SN-38經(jīng)肝臟尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-GT，主要由UGTlAl、UGT1A7和UGT1A9代謝)葡萄糖醛酸化滅活，生成葡萄糖醛酸化SN-38 (SN-38G),從而保護(hù)健康細(xì)胞免受伊立替康毒性的影響。但UGTlAl酶的UGT1A1*28的形式不能催化SN-38，結(jié)果聚集在體內(nèi)的SN-38引發(fā)腹瀉或嗜中性白血球減少癥等其他毒性，UGT1A1*28的突變使UGTlAl的轉(zhuǎn)錄活性下降三分之二，UGT1A1*6的突變導(dǎo)致酶活性降為野生型的49%，因此，2005年，美國(guó)FDA要求在伊立替康藥品標(biāo)簽上加入警示,建議患者在使用伊立替康前先檢查是否帶有UGT1A1*28 突變。目前醫(yī)院用于UGTlAl基因分型檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”是PCR-直接測(cè)序法，但直接測(cè)序法的敏感性不高，只能檢測(cè)出突變細(xì)胞比率在10-20%以上的腫瘤組織，對(duì)于含〈10%突變細(xì)胞的腫瘤組織以及外周血，常規(guī)PCR+直接測(cè)序法幾乎無能為力。相比于直接測(cè)序法，焦磷酸測(cè)序的靈敏性更高、成本更低。焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)是一種基于聚合原理的DNA測(cè)序(確定DNA中核苷酸的順序)方法，是新一代DNA序列分析技術(shù)。它是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，只加入一種dNTTP，若該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)(PPi)。PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號(hào)，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值。每個(gè)峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。通過分析出峰情況，達(dá)到測(cè)定DNA序列的目的目前市場(chǎng)上還沒有利用焦磷酸技術(shù)進(jìn)行UGTlAl的基因多態(tài)性檢測(cè)的產(chǎn)品。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種特異性高、準(zhǔn)確性好、能夠定性檢測(cè)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶IAl (UGTlAl)基因分型的測(cè)序引物對(duì)及其試劑盒。為了達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)提供的技術(shù)方案為一種定性檢測(cè)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶IAl (UGTlAl)基因分型的測(cè)序引物對(duì)，所述引物對(duì)為如下引物 UGT1A1*6 正向擴(kuò)增引物5' -CAGCAGAGGGGACATGAAAT-3' (SEQ IDN0. I)；UGT 1A1*6 反向擴(kuò)增引物5' -CTTTGGAATGGCACAGGGTAC-3' (SEQ IDN0. 2)UGT1A1*6 測(cè)序引物5' -CTTCAAGGTGTAAAATGC-3' (SEQ ID NO. 3)UGT1A1*28 正向擴(kuò)增引物5' -TGAAAGTGAACTCCCTGCTACC-3' (SEQID NO. 4)UGT1A1*28 反向擴(kuò)增引物5' -TCCACTGGGATCAACAGTATCTT-3' (SEQID NO. 5)UGT1A1*28 測(cè)序引物5' -CGCCCTCTCCTACTTA-3' (SEQ ID NO. 6)其中，UGT1A1*6正向擴(kuò)增引物(SEQ ID NO. I)和 UGT1A1*28 (SEQ IDN0.4)正向擴(kuò)增引物的5'端分別進(jìn)行生物素標(biāo)記。一種定性檢測(cè)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶IAl基因分型的測(cè)序試劑盒，所述試劑盒包括含有SEQ ID NO. 2所示反向擴(kuò)增引物的PCR反應(yīng)液1，含有SEQ ID NO. 5所示反向擴(kuò)增引物的PCR反應(yīng)液2，SEQ ID NO. I和SEQ IDN0. 4所示的正向擴(kuò)增引物，SEQ IDNO. 3和SEQ ID NO. 6所示的測(cè)序引物；其中，SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 5所示引物的5，端進(jìn)行生物素標(biāo)記。進(jìn)一步地，所述試劑盒中還包括質(zhì)控品TAYGGTTTGCA (SEQ ID NO. 7) (controloligo)和作為空白對(duì)照品的超純水；質(zhì)控序列是由QIAGEN設(shè)計(jì)合成的一段寡聚核苷酸鏈，用于檢測(cè)PyroMark Q24測(cè)序儀的各項(xiàng)性能指標(biāo)。進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括UGT1A1*6陽(yáng)性對(duì)照品1，UGT1A1*6陽(yáng)性對(duì)照品2，UGT1A1*6陽(yáng)性對(duì)照品3 ;UGT1A1*28陽(yáng)性對(duì)照品1，UGTIAl氺28陽(yáng)性對(duì)照品2，UGTIAl氺28陽(yáng)性對(duì)照品3 ；所述UGT1A1*6陽(yáng)性對(duì)照品I為插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的UGT1A1*6野生純合子質(zhì)粒；所述UGT1A1*6陽(yáng)性對(duì)照品2為插有SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列的UGT1A1*6突變純合子質(zhì)粒；UGT1A1*6陽(yáng)性對(duì)照品3為由所述UGT1A1*6突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*6野生純合子質(zhì)粒組成的UGT1A1*6質(zhì)粒混合物；所述UGT1A1*28陽(yáng)性對(duì)照品I為插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的UGT1A1*28野生純合子質(zhì)粒；UGT1A1*28陽(yáng)性對(duì)照品2為插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的UGT1A1*28突變純合子質(zhì)粒；UGT1A1*28陽(yáng)性對(duì)照品3為由所述UGT1A1*28突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*28野生純合子質(zhì)粒組成的UGT1A1*28質(zhì)粒混合物；其中，質(zhì)粒載體為pMD18-T質(zhì)粒；所述UGT1A1*6質(zhì)粒混合物中UGT1A1*6突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*6野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為I: I ;所述UGT1A1*28質(zhì)粒混合物中UGT1A1*28突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*28野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1。所述的PC本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種定性檢測(cè)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1基因分型的測(cè)序引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)為SEQ？ID？NO.1和SEQ？ID？NO.4所示的正向擴(kuò)增引物，SEQ？ID？NO.2和SEQ？ID？NO.5所示的反向擴(kuò)增引物，SEQ？ID？NO.3和SEQ？ID？NO.6所示的測(cè)序引物；其中，SEQ？ID？NO.1和SEQ？ID？NO.4所示引物的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：周姍，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：長(zhǎng)沙三濟(jì)生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：