焦磷酸測序法檢測FGFR2基因多態(tài)性試劑盒及方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種焦磷酸測序法檢測FGFR2基因多態(tài)性試劑盒及方法。所述試劑盒對(duì)FGFR2基因多態(tài)性進(jìn)行檢查，具體是指RS2981582單核苷酸多態(tài)性。試劑盒包含如SEQIDNO.2-4所示的引物。本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒，可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快捷、高通量對(duì)FGFR2基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，從而達(dá)到對(duì)乳腺癌易感風(fēng)險(xiǎn)的有效預(yù)測、預(yù)防。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的是涉及焦磷酸測序法檢測/基因多態(tài)性的試劑盒及方法。
技術(shù)介紹
乳腺癌(Breast Cancer)是來自乳腺終末導(dǎo)管小葉上皮的惡性腫瘤。發(fā)病率在過去50年中呈緩慢上升趨勢(shì)，已躍居女性惡性腫瘤第一位。乳腺癌常發(fā)與于4(Γ60歲的婦女，小于35歲得女性較少發(fā)病。男性乳腺癌罕見，約占全部乳腺癌的1%左右。乳腺癌多數(shù)發(fā)生于乳腺外上象限，其次為乳腺中央?yún)^(qū)和其他象限。乳腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，雌激素長期作用、家族遺傳傾向，環(huán)境因素和長時(shí)間大劑量接觸放射線和乳腺癌發(fā)病有關(guān)。約5^10%的乳腺癌患者有家族遺傳傾向。/是成纖維細(xì)胞因子受體家族中的一員，研究發(fā)現(xiàn)該基因突變與患乳腺癌易感性顯著相關(guān)(Nature. 2007; 447(28) : 1087-93)。 / ’/ 基因在rs2981582位點(diǎn)突變后，雜合突變(GA)導(dǎo)致一二三級(jí)患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)比野生型(GG)分別增加32%、31%和12%，純合突變(AA)導(dǎo)致一二三級(jí)患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)比野生型(GG)分別增加 83%、68% 和 32% (Plos Genet. 2008. 4(4) : el000054)。FGFR2基因突變導(dǎo)致乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加，該基因位點(diǎn)的突變檢測對(duì)乳腺癌的預(yù)防，早期診斷和治療具有重要意義。有乳腺癌、卵巢癌或其它癌癥家族史的人群，有乳腺癌良性腫瘤病史者，未生育或35歲以后才生育的人群，月經(jīng)初潮早，絕經(jīng)較晚，經(jīng)期長者，經(jīng)常攝取高脂肪或高動(dòng)物性脂肪、愛吃熟牛肉的人群，經(jīng)常口服避孕藥的人群，經(jīng)常接觸各種化學(xué)致癌劑、接受各種物理輻射、大量食用腌制食品以及吸煙、酗酒的人群，轉(zhuǎn)移癌癥至乳房者，不常運(yùn)動(dòng)或易患病人群更應(yīng)該及早的進(jìn)行該基因的檢測。對(duì)于/ ’/ 基因檢測高患病風(fēng)險(xiǎn)的人群，應(yīng)該在飲食、生活、運(yùn)動(dòng)、保健、健康體檢等方面進(jìn)行科學(xué)合理的安排，以達(dá)到降低乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)。裔、h，F(xiàn)GFR2基因多態(tài)性對(duì)乳腺癌疾病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，尤其是一些特殊人群患病的預(yù)測，具有重要的臨床意義。開發(fā)快速、高效、準(zhǔn)確、便捷、經(jīng)濟(jì)的檢測/ '/ 基因多態(tài)性檢測試劑盒將為乳腺癌的發(fā)生起到預(yù)測、預(yù)防作用。焦磷酸測序(Pyro sequencing)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù),該技術(shù)無須進(jìn)行電泳，DNA片段也無須熒光標(biāo)記，是一種通用型技術(shù)平臺(tái)。該技術(shù)具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準(zhǔn)確、高通量等特點(diǎn)，符合臨床大樣本檢測要求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)旨在提供一種焦磷酸測序法檢測/ ’/ 基因(SEQ ID NO. I)多態(tài)性的試劑盒及方法，以實(shí)現(xiàn)快速、簡便、準(zhǔn)確、高效、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的檢測FGFR2 SNP。為了達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)提供的技術(shù)方案為 一種焦磷酸測序法檢測/基因多態(tài)性的試劑盒，包括如下引物 (I)擴(kuò)增引物上游引物5’ -GAATAAAACGGCAGATCCCA-3’ (SEQ ID NO. 2)；下游引物5’ -ACGAGATGTGTTCCCAGAGC-3’ (SEQ ID NO. 3)； 其中，下游引物的5’進(jìn)行生物素標(biāo)記； (2)測序引物:5，-GCCACTTAATGAACCTGT-3，(SEQ ID NO. 4)； 試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑。一種應(yīng)用上述試劑盒檢測FGFR2基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟(1)DNA 提取； (2)聚合酶鏈反應(yīng) 配制 50 μ I PCR 擴(kuò)增體系，包含10 X PCR buffer 5. 0μ I, dNTP I. 5μ I, FGFR2-游引物 0·5μ1，F(xiàn)GFR2 (RS2981582)下游引物(λ 5 μ 1，rTaqO. 5 μ 1，水 4L O μ 1，模板I. 0μ I ;循環(huán)程序?yàn)?5 oC 5min預(yù)變性;依次在95°C 30S,50°C 30S,72°C 30S，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72°C保持5min，最終保持在4 °e，得擴(kuò)增產(chǎn)物； (3)焦磷酸測序單鏈樣本純化； (4)焦磷酸測序及結(jié)果分析。本專利技術(shù)的試劑盒對(duì)/ ’/ RS2981582目標(biāo)序列進(jìn)行分析和檢測，該目標(biāo)序列包括野生型 CACTTAATGAACCTGTTTGCGGAGAGTCCACCTGGTGCCTG (SEQ ID NO. 5)和突變型 CACTTAATGAACCTGTTTGTGGAGAGTCCACCTGGTGCCTG (SEQ ID NO. 6);擴(kuò)增出的片段長為 145bp。由于設(shè)計(jì)了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本專利技術(shù)的試劑盒適用于對(duì)/基因多態(tài)性進(jìn)行快速檢測，可廣泛應(yīng)用于臨床上對(duì)乳腺癌發(fā)生的預(yù)測與預(yù)防。與現(xiàn)有技術(shù)相比，其應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行短DNA序列分析，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程；具有高通量、低成本等特點(diǎn)；PCR產(chǎn)物即可直接用于測序，不需進(jìn)行產(chǎn)物純化等二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小。附圖說明圖I為本專利技術(shù)/ (RS2981582)焦磷酸測序結(jié)果。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)上述試劑盒及檢測方法進(jìn)行詳細(xì)描述。實(shí)施例I :FGFR2~^roV (上游引物)5’ -GAATAAAACGGCAGATCCCA-3’ (SEQ ID NO. 2)；FGFR2imoR (下游引物)5’ -ACGAGATGTGTTCCCAGAGC-3’ (SEQ ID NO. 3)； 測序引物:5，-GCCACTTAATGAACCTGT-3，(SEQ ID NO. 4)； I. DNA提取 I. I實(shí)驗(yàn)前試劑材料準(zhǔn)備與檢查工作如下 (I)檢查試劑盒保質(zhì)期以及確保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相應(yīng)標(biāo)識(shí)處打勾V ； (2)異丙醇(如無，可用無水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高壓滅菌有效期內(nèi)的I. 5mL Eppendorf管和各類移液槍頭。I. 2從4°C冰箱中取出裝有全血的EDTA抗凝管，上下顛倒數(shù)次混勻； I. 3在I. 5mL Eppendorf管對(duì)應(yīng)標(biāo)本唯一性標(biāo)識(shí)做好標(biāo)記；I.4 分別移取 900uL Cell Lysis Solution 加至滅菌的 I. 5mL Eppendorf 管；I. 5小心移取300uL全血轉(zhuǎn)移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管； I. 6蓋上Eppendorf管蓋，室溫孵育IOmin ； I. 713, OOOrpm室溫離心20秒； I. 8取出Eppendorf管,觀察白色沉淀； I. 9開Eppendorf管蓋，手持管底部，傾斜EP管口棄去部分紅色上清，盡量將紅色上清吸盡； I. 10蓋上Eppendorf管,用手指彈擊EP管底部,使白色沉淀重懸； 1.11移取300111^ Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，蓋上管，上下顛倒數(shù)次混勻； I. 12 打開 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述·Eppendorf管中，蓋上管管，振蕩器上劇烈振蕩20秒；13，OOOrpm室溫離心3min ； I. 13移取上清轉(zhuǎn)移到新的已滅菌I. 5mL Eppendorf管； I. 14移取300uL本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種焦磷酸測序法檢測FGFR2基因多態(tài)性試劑盒，其特征在于，包括如下引物：（1）擴(kuò)增引物：？？？？？上游引物：5’？GAATAAAACGGCAGATCCCA？3’；？？？？？下游引物：5’？ACGAGATGTGTTCCCAGAGC？3’；？？？？？其中，下游引物的5’進(jìn)行生物素標(biāo)記；（2）測序引物：5’？GCCACTTAATGAACCTGT？3’。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：曹杉，周宏灝，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：