本發明專利技術提供一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3基因的核心啟動子及其功能性分子標記與應用，屬于生物化學遺傳育種技術領域，具體是通過反轉錄RT-PCR和實時熒光定量RT-qPCR的方法提供一個奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3候選基因，利用牛HMGB3基因P3啟動子區的1個功能性SNP位點的信息，并且采用分子生物學相關技術鑒別奶牛在這個位點的基因型，選擇具有乳腺炎抗性的基因型個體。選擇有利的基因型個體留種，可以提高HMGB3基因抗性基因型在奶牛群體中的頻率，從而提高群體抗奶牛乳腺炎的能力，降低奶牛乳腺炎的發病率，減少經濟損失。本發明專利技術為奶牛的乳腺炎抗性遺傳改良提供了一種新的方法。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物化學遺傳育種
，具體地說是一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性的HMGB3基因啟動子區功能性分子標記位點及其 在奶牛遺傳改良中的應用。
技術介紹
乳腺炎是奶牛飼養中最為常見、復雜的疾病之一，也是造成奶牛業損失最大的一種疾病。是乳腺組織受到物理、化學、微生物等的刺激所發生的炎性變化，其特點是乳中的體細胞增多，乳腺組織發生病理變化，乳的性狀品質發生異常。據估計，大約95%的病例是由金黃色葡萄球菌(Staph, aureus)、鏈球菌(Strep, uberis)和大腸桿菌(E. coli)感染引起，每年因乳腺炎造成的損失高達350億美元(Wellenberg等，2002)。該病所造成的經濟損失包括降低牛奶的產量和乳品的質量和風味、增加奶牛的淘汰率、炎癥的治療費以及額外的勞動支出。同時乳腺炎的病原菌還可通過牛奶而危害人體健康。有關奶牛乳腺炎發病機理和防治的研究已有100多年的歷史，并取得了顯著的進展。然而，奶牛乳腺炎是一種非常復雜的疾病，盡管許多國家都已經對各種乳腺炎實施綜合防治措施，但它是一種受多因素影響的疾病，很難控制。目前，對乳腺炎的控制與預防措施并沒有從整體上降低乳腺炎的發病率，而且乳腺炎也是奶牛生產中抗生素使用的最主要原因(Villli，2001)。因此，我們迫切需要探討其它途徑來降低乳腺炎的發病率，通過遺傳選擇來提高奶牛乳腺炎抗性被認為是解決乳腺炎問題的一種最好的長期策略(Burton等，2001)。若通過遺傳育種手段，可使奶牛增強乳腺炎的抗性，減少藥物的使用量，改善牛奶質量安全，減少經濟損失，有望從根本上解決乳腺炎這一長期困擾著世界奶業發展的難題。奶牛抗性的遺傳力很低，基于表型選擇的遺傳改良效果不佳。而奶牛分子育種可以實現奶牛的早期選擇，大大縮短奶牛遺傳改良的世代間隔，節約選育成本，提高選擇效率。啟動子(promoter)是基因中一段能使基因進行轉錄的脫氧核糖核酸(DNA)序列。它可以被RNA聚合酶辨認，并開始轉錄。在核糖核酸(RNA)合成中，啟動子可以和決定轉錄的開始的轉錄因子產成相互作用，控制基因表達(轉錄)的起始時間和表達的程度，包含核心啟動子區域和調控區域，就像“開關”，決定基因的表達與否，繼而控制細胞開始生產哪一種蛋白質。啟動子本身并無編譯功能，但它擁有對基因翻譯氨基酸的指揮作用，就像一面旗幟，其核心部分是非編碼區上游的RNA聚合酶結合位點，指揮聚合酶的合成。因此，該區域的啟動子發生突變(變異)，將對基因的表達有著毀滅性作用。例如，啟動子區中的單核苷酸突變(SNP)可影響基因的表達調控、基因功能等，對個體的表型具有重要的影響，根據基因型可以選擇出具有潛在不同的表型的個體。因此，基于功能性的分子標記輔助選擇的分子育種技術具有很好應用潛力。高遷移率族蛋白(High mobility group box, HMGB)是一種非組蛋白染色體蛋白質。通常位于細胞內，可參與多種生物學的過程，包括維持核小體結構、調節基因轉錄、核糖核酸形成、DNA修復等。染色體HMGB蛋白包括HMGB1、HMGB2、HMGB3是所有由核酸受體調控的先天性免疫反應的激發所必不可少的(Yanai H, Ban T, Wang Z, et a I. HMGBproteins function as universal sentinels for nucIeic-acid-mediated innateimmune responses. Nature. 2009Nov 5 ；462 (7269) :99-103)。HMGB 可能充當細胞內核酸的普適性“哨兵”。HMGBU HMGB2、HMGB3是根據結合DNA的HMG盒的功能域區分的。其中，HMGB3據報道有兩個轉錄本(ΝΜ_001076285. 2和NM_001113257. 2)。到目前為止，牛HMGB3基因的兩個轉錄本的表達調控模式以及它在奶牛乳腺炎方面的功能性研究尚未見報道。
技術實現思路
本專利技術的技術任務是解決現有技術的不足，提供一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3基因的核心啟動子及其功能性分子標記與應用。本專利技術的技術方案改善種群奶牛的抗乳腺炎能力的方法是通過反轉錄RT-PCR和實時熒光定量RT-qPCR的方法提供一個奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3候選基因，同時為了深入研究HMGB3兩個轉錄本的表達調控模式，利用在線軟件分析發現牛HMGB3基因共有3個啟動子區P1、P2和P3，進一步通過構建載體、細胞轉染、啟動子活性測定和熒光強度測定實驗發現了牛HMGB3基因3個啟動子的核心區域，并且在第3個啟動子P3的核心區域內 發現了一個SNP，構建EGFP-HMGB3-P3載體，經293T細胞轉染后，發現該SNP位點可影響啟動子P3活性，屬于功能性位點，利用該SNP與奶牛乳中體細胞評分SCS的關聯分析表明該SNP與奶牛乳腺炎有關，選擇有利的等位基因型個體留種，從而改善種群奶牛的抗乳腺炎能力。影響奶牛乳腺炎易感/抗性的HMGB3基因核心啟動子區的鑒定方法是通過實時反轉錄RT-PCR和熒光定量RT-qPCR的方法發現目的基因HMGB3在正常的和患乳腺炎的奶牛乳腺組織中mRNA存在差異表達；構建不同長度片段的pGL3-basiC-HMGB3雙熒光素酶報告基因載體，以及具有野生型和突變型堿基的PEGFP-N1-HMGB3載體，分別轉染293T細胞，確定牛HMGB3基因的核心啟動子區；通過對牛HMGB3基因核心啟動子區進行直接測序分析，在HMGB3基因的第3啟動子P3內發現一個單核苷酸突變g. +2690C > T，它位于潛在的轉錄因子結合位點上，可影響啟動子P3的轉錄活性；通過奶牛群體基因型和乳中體細胞評分的關聯分析，證明這個位點為功能性位點，且與奶牛乳腺炎有關。實現影響奶牛乳腺炎易感/抗性的HMGB3基因核心啟動子區的鑒定以及利用該鑒定改善種群奶牛的抗乳腺炎能力的方法步驟是a、篩選HMGB3基因作為奶牛乳腺炎易感/抗性候選基因a. a RT-PCR檢測HMGB3基因兩個轉錄本在不同組織中的表達提取患乳腺炎奶牛的乳腺組織樣品和正常牛的不同組織樣品的mRNA，反轉錄后用來分析HMGB3mRNA的相應組織的表達量， 利用RT-PCR定量的結果，反映轉錄本HMGB3-TV1和HMGB3-TV2的mRNA在各組織中的表達情況，來確定HMGB3基因與奶牛乳腺炎的關系；a. b熒光定量RT-qPCR檢測HMGB3基因在乳腺組織中的表達為了進一步分析HMGB3的表達量和奶牛乳腺炎的關系，分別選擇正常的和患乳腺炎的乳腺組織進行RT-qPCR，相對表達水平用管家基因β -actin做內參，每個樣品重復實驗，分析熒光定量RT-qPCR的結果，比較患乳腺炎的組織HMGB3mRNA的表達量和其在正常奶牛乳腺組織的表達量；結果表明，患乳腺炎的組織HMGB3mRNA的表達顯著高于其在正常奶牛乳腺組織的表達；b、牛HMGB3基因啟動子P1、P2、P3的克隆和活性分析生物信息學genomatix軟件預測發現牛HMGB3基因有3個啟動子，為了進一步驗證這3個啟動子是否具有啟動子活性，而且確定其核心啟動子區，利用序列遞減的方法對Pl和P2啟動子區不同片段構建入pGL3-basic載體并且本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種改善種群奶牛的抗乳腺炎能力的方法，其特征在于：通過反轉錄RT？PCR和實時熒光定量RT？qPCR的方法提供一個奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3候選基因，同時為了深入研究HMGB3兩個轉錄本的表達調控模式，利用在線軟件分析發現牛HMGB3基因共有3個啟動子區：P1、P2和P3，進一步通過構建載體、細胞轉染、啟動子活性測定和熒光強度測定實驗發現了牛HMGB3基因3個啟動子的核心區域，并且在第3個啟動子P3的核心區域內發現了一個SNP，構建EGFP？HMGB3？P3載體，經293T細胞轉染后，發現該SNP位點可影響啟動子P3活性，屬于功能性位點，利用該SNP與奶牛乳中體細胞評分SCS的關聯分析表明該SNP與奶牛乳腺炎有關，選擇有利的等位基因型個體留種，從而改善種群奶牛的抗乳腺炎能力。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃金明，王秀革，李黎明，鞠志花，齊超，張燕，李秋玲，王長法，李榮嶺，杭蘇琴，侯明海，高運東，仲躋峰，
申請(專利權)人：山東省農業科學院奶牛研究中心，
類型：發明
國別省市：
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