公開了基于ＤＮＡ的、利用擴(kuò)增引物或探針檢測、鑒定和定量測定測試樣品中下述來源的ＤＮＡ的方法：（ｉ）任何細(xì)菌，（ｉｉ）無乳鏈球菌、腐生葡萄球菌、屎腸球菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌和白假絲酵母，為（ｉｉｉ）鏈球菌、葡萄球菌、腸球菌、奈瑟氏球菌和假絲酵母各屬的任何種類。也公開了基于ＤＮＡ的、利用擴(kuò)增引物或探針檢測、鑒定和定量測定測試樣品中選自下述的抗生素抗性基因的方法：ｂｌａ↓［ｔｅｍ］、ｂｌａ↓［ｓｈｖ］、ｂｌａ↓［ｒｏｂ］、ｂｌａ↓［ｏｘａ］、ｂｌａＺ、ａａｄＢ、ａａｃＣ１、ａａｃＣ２、ａａｃＣ３、ａａｃ６’－ＩＩａ、ａａｃＡ４、ａａｄ（６’）、ｖａｎＡ、ｖａｎＢ、ｖａｎＣ、ｍｓｒＡ、ｓａｔＡ、ａａｃ（６’）－ａｐｈ（２”）、ｖａｔ、ｖｇａ、ｅｒｍＡ、ｅｒｍＢ、ｅｒｍＣ、ｍｅｃＡ、ｉｎｔ和ｓｕｌ。上述微生物種、屬和抗性基因均是多種臨床標(biāo)本中臨床相關(guān)的和常見的，這些基于ＤＮＡ的檢測法比較快速、準(zhǔn)確，可以用于臨床微生物為實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行常規(guī)診斷。這些新型方法應(yīng)可用于提高微生物感染診斷的速度和準(zhǔn)確度，因此可以達(dá)到更有效的治療。也要求了用于（ｉ）細(xì)菌的通用檢測和定量測定，和／或（ｉｉ）上述細(xì)菌和真菌種和／或?qū)俚臋z測，鑒定和定量測定，和／或（ｉｉｉ）上述抗生素抗性基因的檢測，鑒定和定量測定的診斷試劑盒。（*該技術(shù)在2017年保護(hù)過期，可自由使用*）
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
技術(shù)介紹
用于細(xì)菌鑒定和敏感性試驗(yàn)的傳統(tǒng)方法在過去，通常是使用例如API20ETM系統(tǒng)(bioMe′rieux)等生物測試方法，根據(jù)細(xì)菌利用不同的底物作為碳和氮源的能力來鑒定細(xì)菌的。就敏感性試驗(yàn)來說，臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室使用的方法包括平板擴(kuò)散、瓊脂稀釋和肉湯微量稀釋法。雖然基于生物化學(xué)試驗(yàn)和抗菌敏感性試驗(yàn)的鑒定方法是有效的，但由于需要鑒定臨床樣品中的細(xì)菌及確定其對抗微生物藥劑的敏感性而必須經(jīng)過連續(xù)兩次過夜培養(yǎng)，所以至少要用兩天時(shí)間才能得到初步鑒定結(jié)果。為進(jìn)行快速微生物鑒定和敏感性試驗(yàn)，已有一些市售的使用高級(jí)和貴重裝置的自動(dòng)檢測系統(tǒng)(即Dade DiagnoticsCorp.的MicroScan系統(tǒng)和bioMe′rieux的Vitek系統(tǒng))(Stager andDavis，臨床微生物綜述，5302-327)。這些系統(tǒng)需要較短的保溫時(shí)間，因而可在不到6小時(shí)的時(shí)間內(nèi)完成大多數(shù)細(xì)菌鑒定和敏感性試驗(yàn)。然而，這些快速系統(tǒng)總是需要首先將細(xì)菌分離成純培養(yǎng)物，這一過程對于純培養(yǎng)物要花費(fèi)至少18小時(shí)，對于混合培養(yǎng)物則需2天時(shí)間。最快的鑒定系統(tǒng)是auto SCAN-Walk-AwayTM系統(tǒng)(Date DiganosticsCorp.)，其可在2小時(shí)內(nèi)從標(biāo)準(zhǔn)化接種物中鑒定出革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌，并在5.5小時(shí)內(nèi)得到對大多數(shù)抗生素的敏感性模式。然而，該系統(tǒng)對腸細(xì)菌以外菌種的非確定性鑒定的比例特別高(即3.3至40.5％)。對腸細(xì)菌的非確定性鑒定比例為2.7至11.4％(CroizeJ.，1995，Lett.Infectiol.，10109-113；York等，1992，臨床微生物學(xué)雜志，302903-2910)。在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中可常規(guī)分離并鑒定臨床樣品中的各種細(xì)菌和真菌。表1和2中列出了各種類型臨床樣品中最常分離到的細(xì)菌和真菌病原體的出現(xiàn)率。這些病原體常常與人們在醫(yī)院和公共場所獲得的感染有關(guān)，因而被認(rèn)為是最具臨床重要性的。在臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中檢測的臨床樣品臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中收到的大多數(shù)樣品是尿樣和血樣。在I′Universite′Laval中心醫(yī)院(CHUL)的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中，尿樣和血樣分別占收到樣品的大約55％和30％(表3)。剩下15％的臨床樣品包括各種生物液體，包括痰、膿、腦脊液、滑液等(表3)。尿道、呼吸道和血流感染通常是由細(xì)菌所致，需要抗微生物治療。事實(shí)上，對臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中收到的所有臨床樣品的檢測通常是鑒定細(xì)菌和敏感性測試。臨床樣品中常規(guī)病原體的鑒定尿樣對尿樣中病原體的檢查在常規(guī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中非常普遍，已經(jīng)開發(fā)出了許多測試方法。然而，通用的標(biāo)準(zhǔn)仍然是經(jīng)典的半定量性平板培養(yǎng)物方法，其中將1μl尿液在平板上劃線，并培養(yǎng)18-24小時(shí)。然后對菌落計(jì)數(shù)以確定每升尿液中菌落形成單位(CFU)的總數(shù)。細(xì)菌尿道感染(UTI)通常與尿液中細(xì)菌數(shù)為107CFU/L或更高有關(guān)。然而，尿液中細(xì)菌數(shù)為107CFU/L以下時(shí)也有可能造成感染，對于易患病或插入了導(dǎo)管的那些患者尤為如此(Stark和Maki，1984，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，311560-564)。重要的是，臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中檢測的約80％的尿樣被視為是陰性的(即細(xì)菌計(jì)數(shù)小于107CFU/L；表3)。利用標(biāo)準(zhǔn)生化測試方法對經(jīng)培養(yǎng)物鑒定為陽性的尿樣進(jìn)一步鑒定以鑒別細(xì)菌病原體，還檢測其對抗生素的敏感性。這種生化和敏感性測試通常需要18-24小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌病原體的準(zhǔn)確和快速尿液篩選方法可使得更快速地鑒定出陰性樣品，并更有效地治療和護(hù)理患者。已將數(shù)種快速鑒別方法(UriscreenTM，UTIscreenTM，F(xiàn)lash TrackTMDNA探針等)與基于細(xì)菌病原體培養(yǎng)物的更慢的標(biāo)準(zhǔn)生化方法進(jìn)行了比較。這些快速測試方法雖然更為快速，但靈敏度較低，特異性也較差，而且假陰性和假陽性結(jié)果也很多(Koening等，1992，臨床微生物學(xué)雜志，30342-345；Pezzlo等，1992，臨床微生物學(xué)雜志，30640-684)。血樣對微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中收到的血樣常常進(jìn)行培養(yǎng)。血液培養(yǎng)物系統(tǒng)可以是人工的、半自動(dòng)的或完全自動(dòng)的。BACTEC系統(tǒng)(BectonDickinson)和BacTALert系統(tǒng)(Organon Teknika公司)是最為廣泛使用的兩種自動(dòng)化血液培養(yǎng)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)將血液培養(yǎng)瓶置于細(xì)菌生長最佳條件下培養(yǎng)。利用高靈敏性細(xì)菌生長檢測儀連續(xù)地監(jiān)測細(xì)菌的生長，以便檢測出早期陽性。一旦檢測到細(xì)菌生長，即直接對血液培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，然后用于接種營養(yǎng)瓊脂平板。隨后，用前述的自動(dòng)化系統(tǒng)，對分離的細(xì)菌菌落進(jìn)行細(xì)菌鑒定和敏感性測試。如果培養(yǎng)6-7天后未檢測到病原體生長，通常將這種培養(yǎng)瓶報(bào)告為陰性。正常情況下，絕大部分血液培養(yǎng)物報(bào)道為陰性。例如，CHUL的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室在1994年2月至1995年1月期間陰性血液培養(yǎng)物的比例為93.1％(表3)。其他臨床樣品在由臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室接受后，處理除血液和尿液以外的正常情況下得自無菌部位的所有其他體液(即腦脊液、滑液、胸腔液、心包液等)以進(jìn)行直接顯微鏡檢查和繼后培養(yǎng)。同樣，大多數(shù)臨床樣品都是培養(yǎng)陰性的(表3)。對于那些并非得自無菌部位的臨床樣品，如痰和糞便樣品來說，由于有正常菌群污染，所以用培養(yǎng)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)診斷的問題較多。從污染物中純化出可能與感染相關(guān)的細(xì)菌病原體，然后按以前描述的方法進(jìn)行鑒定。當(dāng)然，細(xì)菌的常用檢測法并不適用于診斷這些非無菌部位的細(xì)菌感染。另一方面，用于這些樣品的種或?qū)俚臋z測和鑒定及抗生素抗性基因檢測的基于DNA的試驗(yàn)應(yīng)是很有用的，并且相比于傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定和敏感性試驗(yàn)方法有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。用任何臨床樣品進(jìn)行的基于DNA的檢測法顯然需要建立由臨床樣品直接檢測和鑒定細(xì)菌的快速和準(zhǔn)確的診斷試驗(yàn)。基于DNA的技術(shù)迅速而且準(zhǔn)確，并且可能大大改善對傳染性疾病的診斷(Persing et al.，1993，診斷分子生物學(xué)原理與應(yīng)用，American Society for Microbiology，Washington，D.C.)。作為本專利技術(shù)主題的DNA探針和擴(kuò)增引物適用于直接從血液培養(yǎng)物、血液、尿液、痰、腦脊液、膿及其他標(biāo)本(表3)等任何一種臨床標(biāo)本檢測并鑒定細(xì)菌或真菌。從迅速和準(zhǔn)確的角度看，本專利技術(shù)中提出的基于DNA的試驗(yàn)優(yōu)于目前微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室用于由任何臨床樣品進(jìn)行常規(guī)診斷的標(biāo)準(zhǔn)生化方法。因?yàn)檫@些試驗(yàn)只在大約1小時(shí)內(nèi)完成，所以它們?yōu)榕R床醫(yī)生提供了新的診斷工具，從而有利于提高抗微生物劑的治療效率。也可用這些檢測法測試得自人以外生物體(例如其它靈長類、鳥類、植物、哺乳動(dòng)物、農(nóng)場動(dòng)物、家畜等)的臨床標(biāo)本。高百分比的培養(yǎng)陰性標(biāo)本在所接受的用于常規(guī)診斷的所有臨床標(biāo)本中，大約80％的尿樣和更多(約95％)的其他類型臨床標(biāo)本都是細(xì)菌病原體陰性的(表3)。除了在種或?qū)偎缴翔b定給定標(biāo)本中的細(xì)菌外，還希望用檢測任何細(xì)菌存在的試驗(yàn)(即通用細(xì)菌檢測)篩選出高比例的陰性臨床標(biāo)本。這樣一種篩選試驗(yàn)可以是基于對所有細(xì)菌中的高保守的基因靶進(jìn)行的DNA的PCR擴(kuò)增。細(xì)菌陰性的標(biāo)本不會(huì)被此檢測法擴(kuò)增。另一方面，細(xì)菌陽性的那些標(biāo)本用此檢測法檢測會(huì)得到陽性擴(kuò)增信號(hào)。發(fā)展基于DNA的快速診斷試驗(yàn)快速診斷試驗(yàn)對處理感染將具有重要影響。DNA探針和DNA擴(kuò)增技術(shù)比鑒定本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
使用特異性、普遍適用并靈敏的探針和／或擴(kuò)增引物從懷疑含有下述細(xì)菌和／或真菌核酸的任何樣品中確定下列來源的核酸的存在和／或量的方法：－選自下列組中的抗生素抗性基因：ｂｌａ↓［ｔｅｍ］、ｂｌａ↓［ｓｈｖ］、ｂｌａ↓［ｒｏｂ］、ｂｌａ↓［ｏｘ ａ］、ｂｌａＺ、ａａｄＢ、ａａｃＣ１、ａａｃＣ２、ａａｃＣ３、ａａｃ６′－Ⅱａ、ａａｃＡ４、ａａｄ（６′）、ｖａｎＡ、ｖａｎＢ、ｖａｎＣ、ｍｓｒＡ、ｓａｔＡ、ａａｃ（６′）－ａｐｈ（２″）、ｖａｔ、ｖｇａ、ｅｒｍＡ、ｅｒｍＢ、ｅｒｍＣ、ｍｅｃＡ、ｉｎｔ和ｓｕｌ，以及－選自下列組中的特定細(xì)菌和真菌菌種：屎腸球菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、無乳鏈球菌、白假絲酵母、腸球菌屬、奈瑟氏球菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬和假絲酵母屬，其中所述每一種核酸或其變體或其部分包 含可與所述探針或引物雜交的選定靶區(qū)域；所述方法包括下列步驟：在雜交或擴(kuò)增的相同條件下使所述樣品與所述探針或引物接觸，并檢測已雜交的探針或擴(kuò)增產(chǎn)物的存在和／或量，以作為所述特定細(xì)菌和／或真菌菌種或?qū)伲瑫r(shí)還有所述細(xì)菌抗生素抗性基因的存在和 ／或量的指征。
【技術(shù)特征摘要】
...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：MG伯吉羅恩，FJ皮卡德，M奧萊特，PH羅伊，
申請(專利權(quán))人：感染診斷IDI公司，
類型：發(fā)明
國別省市：CA[加拿大]
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