本發明專利技術屬于作物遺傳育種領域，公開了蘿卜霜霉病抗性基因緊密連鎖的分子標記。本發明專利技術采用SRAP分子標記方法對高抗霜霉病蘿卜親本（NAU-dhp08）、高感霜霉病蘿卜親本（秋田半節青），以及抗、感親本雜交配制的F2群體單株進行標記基因型分析，通過對F2單株抗性表型與標記基因型連鎖分析，鑒定出370bp緊密連鎖的抗性標記Em9/ga24370，抗性位點與標記間遺傳距離為2.3cM。通過本發明專利技術提供的分子標記方法可用于蘿卜霜霉病抗性育種中標記輔助選擇，快速準確鑒定蘿卜植株霜霉病抗性，克服了常規抗性鑒定方法工作量大、周期長、結果易受環境影響等局限，可以明顯提高抗性基因型選擇效率，加快蘿卜高抗霜霉病新品種選育進程。
【技術實現步驟摘要】
蘿卜霜霉病抗性基因緊密連鎖的分子標記
本專利技術屬于作物遺傳育種領域，涉及蘿卜霜霉病抗性基因緊密連鎖的分子標記。技術背景蘿卜(Raphanus sativus L.)又名萊菔,是一種重要十字花科根菜類蔬菜作物,我國蘿卜種質資源豐富，栽培歷史悠久；蘿卜主要以膨大的肉質直根供食用，具有較高的營養價值和食療功效，深受人們喜愛(汪隆植與何啟偉主編，中國蘿卜，北京科學技術文獻出版社，2005)。霜霉病(downy mildew)是蘿卜生產上一種危害性很大的病害，該病病原菌是鞭毛菌亞門卵菌綱霜霉屬的一種專性活體寄生菌，該病在世界各地均有分布。近幾年，蘿卜霜霉病的病害發生嚴重，尤其是在溫度適宜、潮濕的環境下更易發生，南方適溫高濕的環境為霜霉菌的生活提供了適宜條件，春季保護地栽培更是蘿卜霜霉病的高發季節。蘿卜霜霉病發病部位多為植株葉片、莖部、根部、種株花器官及種莢，在蘿卜整個生長時期(子葉期至采種期)都容易發生，對蘿卜的品質、產量以及良種繁育等造成了嚴重影響。分子標記技術已經被廣泛應用于蔬菜作物遺傳育種研究中。成功進行重要性狀基因緊密連鎖的分子標記鑒定，在品種選育過程中可以跟蹤、檢測特定性狀基因，有效減少或免除傳統育種中繁雜的性狀鑒定工作，還可以通過標記輔助選擇，把多個抗病等重要性狀功能基因聚合到同一優良品系中。相關序列擴增多態性(sequence related amplified polymorphism, SRAP)是一種新型的基于PCR的遺傳標記系統,具有簡單、高效、重復性高等優點(Li G&Quiros CF. Sequence-related amplified polymorph ism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica. Theoretical and Applied Genetics，2001，103:455-461 )。目前， SRAP已成功應用于作物的品種鑒定、遺傳連鎖圖譜構建以及性狀遺傳標記分析工作中。混合分離分析(Bulked SegregantAnalysis, BSA)策略是快速獲得與目標性狀基因緊密連鎖分子標記的有效方法，尤其是對于尚無遺傳連鎖圖或連鎖圖飽和程度較低的植物(Michelmore RffjParan I, Kesseli RV. Identification of markers linked to disease resistance genes by bulked segregant analysis:A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991，88:9828-9832)。在分離群體中選擇目標性狀極端差異的植株構建兩個DNA 池(bulk)，在兩個基因池間表現出多態性的DNA標記，有可能與目標基因連鎖。目前，利用 BSA策略已經標記和定位了許多重要的質量性狀基因，如萵苣抗霜霉病基因、水稻抗癭蠓基因以及抗稻瘟病基因等(方宣鈞，吳為人，唐紀良.作物DNA標記輔助育種.北京科學出版社，2001)。抗病育種是現代作物遺傳育種領域重要的研究方向，選育抗病品種是當前控制作物病害最經濟、最有效的途徑。抗病品種培育過程中，抗性鑒定是關鍵環節之一。蘿卜霜霉病菌為專性寄生真菌，蘿卜霜霉病抗性鑒定評價涉及到病菌收集、活體保存、接種、植株管理、病情調查等多個步驟，傳統接種鑒定不僅費時，而且受接種孢子液濃度、接種環境條件等因素影響，嚴重影響了植株抗性鑒定結果準確性與抗性選擇效率。通過篩選與蘿卜霜霉病抗性基因緊密連鎖的分子標記，在苗期就可利用標記進行霜霉病抗性鑒定，一般廣2 天即可獲得結果，而且不受環境條件的影響，結果快速、準確。這種基于分子標記的基因型選擇(標記輔助選擇)克服了許多基于表型選擇方法的缺點，可以明顯提高目標性狀選擇效率，顯著縮短育種年限，加快抗病新品種培育進程。
技術實現思路
本專利技術的目的在于針對現有技術的上述不足，提供一種蘿卜霜霉病抗性基因緊密連鎖的分子標記。本專利技術的另一目的是提供該分子標記的引物。本專利技術的又一目的是提供該分子標記的應用。本專利技術的目的可通過如下技術方案實現—種蘿卜霜霉病抗性基因緊密連鎖的分子標記Em9/ga2437(!,所述的分子標記Em9/ ga2437Q由序列如SEQ ID NO. I所示的正向引物Em9和序列如SEQ ID NO. 2所示的反向引物 ga24通過PCR擴增具有霜霉病抗性的蘿卜基因組DNA得到，所述的具有霜霉病抗性的蘿卜選自抗病親本‘NAU-dhp08’。與蘿卜霜霉病抗病基因緊密連鎖的分子標記,所述的SRAP分子標記Em9/ga2437(l, 其是用下述方法得到的(I)選取高代自交系抗病親本‘NAU_dhp08’(朱長志，等.利用種子蛋白SDS — PAGE技術進行抗熱蘿卜種質鑒定.中國蔬菜，2010(8):21-25)，和高代自交系感病親本‘秋田半節青’(周志國，等.不同蘿卜品種游離小孢子的誘導及培養體系優化研究.西北植物學報，2007，27(1):33-38)，田間授粉有性雜交產生F1, F1自交產生匕，同時F1回交產生BC 群體；(2)采用人工接種方法對F2單株進行抗病、感病鑒定，統計抗、感分離情況；(3)采用CTAB法提取蘿卜抗病親本自交系‘NAU_dhp08’和感病親本‘秋田半節青'F1及F2單株基因組DNA;(4)采用 BSA (Bulked SegregantAnalysis)法,在 F2 中選取 10 株高抗和 10 株高感單株，將其基因組DNA分別進行等量混合，構建抗池Bk和感池Bs ；(5)米用SRAP分子標記方法進行蘿卜霜霉病抗性分子標記的篩選。首先利用未本和抗、感池(Bulk)基因組DNA進行SRAP引物的篩選，接著將篩選出的多態性引物在組成抗感池的20個單株基因組DNA中進一步驗證，最后在F2單株中利用驗證的多態性引物進行 PCR擴增，對單株進行標記基因型分析，統計多態性引物產生標記條帶的分離情況；(6)根據F2單株標記基因型分析，結合人工接種鑒定結果，采用JoinMap3. O生物軟件進行遺傳連鎖分析，設置LOD最小值為3. O,采用kosambi函數計算遺傳距離，發現SRAP引物Em9/ga24組合產生大小為370bp的Em9/ga2437(l標記與蘿卜霜霉病抗性基因緊密連鎖，遺傳距離為2. 3cM。產生標記Em9/ga2437Q的SRAP引物為Em9 (正向引物) 5’ GACTGCGTACGAATTCTA3’，ga24 (反向引物)5’ TTTTGGGACTGATAGCATTC3’。SRAP-PCR 反應體系為(IOyL) 1XPCR buffer, 3. OmM Mg2+, O. 20mM dNTPs,O. 5U Taq DNA聚合酶，每個引物O. 30 μ M和模板DNAlOng。反應程本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種蘿卜霜霉病抗性基因緊密連鎖的分子標記Em9/ga24370，其特征在于所述的分子標記Em9/ga24370由序列如SEQ?ID?NO.1所示的正向引物Em9和序列如SEQ?ID?NO.2所示的反向引物ga24通過PCR擴增具有霜霉病抗性的蘿卜基因組DNA得到，所述的具有霜霉病抗性的蘿卜選自抗病親本‘NAU?dhp08’。
【技術特征摘要】
1.一種蘿卜霜霉病抗性基因緊密連鎖的分子標記Em9/ga2437(l，其特征在于所述的分子標記Em9/ga24370由序列如SEQ ID NO. I所示的正向引物Em9和序列如SEQ ID NO. 2所示的反向引物ga24通過PCR擴增具有霜霉病抗性的蘿卜基因組DNA得到，所述的具有霜霉病抗性的蘿卜選自抗病親本‘NAU-dhp08’。2.權利要求I所述的蘿卜霜霉病抗性基因緊密連鎖的分子標記Em9/ga2437(l的引物組合Em9/ga24,其特征在于正向引物Em9序列如SEQ ID NO. I所示，反向引物ga24序列如SEQID NO. 2 所示。3.權利要求I所述的蘿卜霜霉病抗性基因緊密連鎖的分子標記Em9/ga2437(l的檢測方法，其特征在于包含如下步驟 Cl)以被檢測的蘿卜基因組DNA為模板，以權利要求2所述的引物組合Em9/ga24進行PCR擴增； (2)能夠擴增出370bp特異條帶的，說明存在蘿卜霜霉病抗性基因緊密連鎖的分子標記Em9/ga2437(l ;未擴增出370bp特異條帶的，說明不存在蘿卜霜霉病抗性基因緊密連鎖的分子標記 E...
【專利技術屬性】
技術研發人員：柳李旺，徐良，蔣秋瑋，武劍，龔義勤，高相敏，
申請(專利權)人：南京農業大學，
類型：發明
國別省市：
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