CFHR1基因型、高密度脂蛋白上CFHR1及氧化磷酸膽堿的測定試劑盒及測定方法技術

本發明專利技術要解決的技術問題是提供年齡相關性黃斑變性（AMD）疾病發生、發展的診斷試劑。本發明專利技術涉及對CFHR1基因型鑒定、血漿樣品中CFHR1含量測定、高密度脂蛋白樣顆粒上CFHR1結合量和CFHR1與氧化特異性抗原結合的試劑盒及其檢測方法。本發明專利技術對年齡相關性黃斑變性（AMD）疾病發生、發展的診斷提供了可靠的參照指標。創造性地確認了不同基因型CFHR1。而本發明專利技術的工作可能會導致在預防和治療老年黃斑退化的新策略，如通過CFHR1活性的抑制或對其下游的參與脈絡膜形成炎癥基因，包括IL-1的活性抑制，以期能預防和治療老年黃斑退化。具有廣闊的開發應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及補體因子H相關蛋白I (CFHRl)的基因型鑒定，CFHRl在血漿中的測定方法，含CFHRl高密度脂蛋白樣顆粒的分離純化，CFHRl對氧化特異性抗原的結合，以及高密度脂蛋白(HDL)上氧化磷脂的檢測，并且通過以上檢測所得到的數據，對年齡相關性黃斑變性進行預警性診斷和治療指導。具體涉及有關的定量檢測試劑盒及其檢測方法。
技術介紹
年齡相關性黃斑變性(AMD)的發病機理涉個體的遺傳變異及環境危險因素(如氧化應激)的相互作用。AMD患者視力的嚴重損失大多是由于脈絡膜新生血管(CNV)出血及滲出，或濕性AMD引起。AMD是老年人不可逆失明的主要原因并影響世界上數以百萬的人。全基因組關聯研究(GWAS)可有效推進基于分子水平的復雜性狀疾病1的研究。但是，對遺傳變異的性狀與發病機制之間的理解仍需實質性的突破?，F已發現AMD的發生與 I號染色體上的補體因子H (CFH)區域密切相關。CFH區域包含兩個主要疾病風險單體，一個由rsl061170 (Y402H)標記，另一個由rs227470(T9標記。這兩個風險單體型一起出現在60%以上的AMD患者中。最近的研究發現，CFH相關蛋白(CFHRs)的拷貝數變異也與AMD相關。特別是，由 rs6677604標記的CFHRl在高密度脂蛋白上的缺失與避免AMD1tu2病變有關。CFHRl基因位于I號染色體長臂31-32區域，其蛋白編碼與CFH的C端具有高度同源性。CFHRs與補體系統中的其它具體效應因子相互結合起調節功能。研究表明，許多老化疾病與氧化應激相關，包括動脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏病和 AMD1m90除了全身整體性的氧化應激，視網膜感光細胞同時還因為與局部氧化產物的接觸所受到氧化應激。視網膜的感光細胞含有大量不飽和脂肪酸磷脂，如磷脂酰膽堿(PtC)等。 這些磷脂是極容易受到氧化應激導致化學結構發生變化，產生各種氧化磷脂(oxPLs)。例如 l-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PAPC, I-掠櫚酉先 ~2~ 花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿)是最常見視網膜磷脂之一。在氧化作用下，其中的雙鍵結構被打斷，從而使磷酸膽堿(PC)基團產生構象變化，變為l-palmitoyl_2-(5’ -oxo-valeroyl )-snglycero-3-phosphocholine(POVPC, I-棕櫚酰 _2_ 氧化戍酰 _sn_ 甘油-3-磷酸膽堿) (圖I)。POVPC可以由鼠天然抗體TEPC15 (通常也叫T15)明確識別。相比之下，TEPC-15卻不與正常細胞膜或天然脂蛋白上的非氧化卵磷脂結合20。通常，oxPLs存在于氧化修飾的低密度脂蛋白(oxLDL)載體或凋亡細胞上。很多研究已經表明oxPL能夠刺激強烈的炎癥反應，并且可以作為一個可靠的氧化應激生物標記物21’22。有研究人員發現，一部分的CFHRl存在于血漿中一種特殊的高密度脂蛋白樣顆粒上。該顆粒包含載脂蛋白A (ΑροΑΙ)、脂多糖結合蛋白(LBP)和磷脂23。由于此高密度脂蛋白樣顆粒僅占小于HDL總量的1%，因此推測它不是脂質轉運的結構組件。相反，它可能具有調節功能，可能是參與和細菌內毒素的結合來調節炎癥反應。然而，CFHRl在此高密度脂蛋白樣顆粒中的確切作用尚沒有被充分探討，尤其是在AMD的研究中。研究者已經在AMD患者的視網膜玻璃膜疣和Bruch膜中檢測到了被氧化修飾的蛋白質和脂24。作為天然防御機制的一部分，CFHRs可能參與這種氧化應激的調節。有報道稱CFHRl缺失(CFHRl Δ )對于AMD風險有保護作用1CU1。但是，其對于AMD風險的影響機制在很大程度上還是未知的。
技術實現思路
本專利技術要解決的第一個技術問題是提供用于從DNA模板中擴增CFHRl基因片段的引物對。本專利技術的技術方案是用于從DNA模板中擴增CFHRl基因片段的引物對，包括標記為rs6677604的CFHRl上SNP基因座CFHRl擴增引物對上游引物5’ -GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3 ’( SEQ ID No 1)下游引物:5，-GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’(SEQ ID No 2)；在此基礎上，本專利技術還提供了用于對標記為rs6677604的CFHRl上SNP基因座進行基因型鑒定的引物，其核苷酸序列5’-TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No 3)。該引物主要是將上述CFHRl擴增引物對的擴增產物進行測序，以測得CFHRl上標記為rs6677604的 SNP基因座的序列，進而得到樣本的基因型。本專利技術要解決的一個技術問題是提供一種用于鑒定人組織樣本DNA中補體因子H 相關蛋白1 (CFHRl)基因型的試劑盒，該試劑盒包含下列成分a、從人組織樣本中提取DNA模板的試劑；b、用于從DNA模板中擴增CFHRl基因片段的引物，包括擴增標記為rs6677604的 CFHRl擴增引物對上游引物:5，-GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3，(SEQID No 1)下游引物:5，-GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’(SEQ ID No 2)；C、用于對DNA擴增產物的片斷進行基因型鑒定的引物序列，包括標記為 rs6677604的CFHRl基因型鑒定的引物序列5， -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No 3)。其中，上述試劑盒中所述的人組織樣本為外周血樣本。本專利技術提供的標記為rs6677604的CFHRl擴增引物對可應用于制備鑒定人組織樣本DNA中補體因子H相關蛋白1 (CFHRl)基因型的試劑盒。本專利技術提供的標記為rs6677604的CFHRl基因型鑒定的引物可應用于制備鑒定人組織樣本DNA中補體因子H相關蛋白1 (CFHRl)基因型的試劑盒。本專利技術提供的鑒定人組織樣本DNA中補體因子H相關蛋白1 (CFHRl)基因型的試劑盒可用于檢測年齡相關性黃斑變性(AMD)患者CFHRl基因型。本專利技術還提供了一種鑒定人組織樣本DNA中補體因子H相關蛋白1 (CFHRl)基因型的方法，該方法包括以下步驟a、從人組織樣本中提取和純化DNA模板；b、利用DNA模板擴增補體因子H相關蛋白1 (CFHR1)基因片段，采用的擴增引物為rs6677604標記的CFHRl擴增引物對上游引物5，-GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3，(SEQID No I)；下游引物:5，-GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’(SEQ ID No 2)；C、使用基因型鑒定的引物序列對步驟b得到的補體因子H的基因片段進行擴增， 得到的產物測序進行基因型SNP鑒定，如果其中保護性等位基因為純合子標記為AA ;其中如果致病性等位基因為純合子標記為GG ;其中如果保護性/致病性等位基因為雜合子標記為AG。其中所述的基因型鑒定的引物為 5’ -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAA TGCGAG-3’ (SEQ ID No 3)。本專利技術還提供了本文檔來自技高網...

【技術保護點】
用于從DNA模板中擴增CFHR1基因片段的引物對，包括標記為rs6677604的CFHR1上SNP基因座CFHR1擴增引物對，其序列如SEQ?ID?No?1和SEQ?ID?No?2所示：上游引物:5’?GATGGAAGACACCAGAGCAGAT?3’（SEQ?ID?No?1）；下游引物:5’?GAATCCATCAGCTTCTACCATT?3’（SEQ?ID?No?2）。

【技術特征摘要】
2011.11.11 CN 201110357825.5;2011.11.14 CN 2011101.用于從DNA模板中擴增CFHRl基因片段的引物對，包括標記為rs6677604的CFHRl上SNP基因座CFHRl擴增引物對，其序列如SEQ ID No I和SEQ ID No 2所示 上游引物5’ -GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3’ (SEQ ID No I)； 下游引物5’ -GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’ (SEQ ID No 2)。2.用于對標記為rs6677604的CFHRl上SNP基因座進行基因型鑒定的引物，其序列如SEQ ID No 3 所示5’ -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No3)。3.權利要求I中所述的引物對在制備鑒定人組織樣本DNA中CFHRl基因型的試劑盒中的應用。4.權利要求2中所述的引物在制備鑒定人組織樣本DNA中CFHRl基因型的試劑盒中的應用。5.用于鑒定人組織樣本DNA中CFHRl基因型的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含下列成分 a、從人組織樣本中提取DNA模板的試劑； b、用于從DNA模板中擴增CFHRl基因片段的引物，包括標記為rs6677604的CFHRl擴增引物對，其序列如SEQ ID No I和SEQ ID No 2所示 上游引物:5，-GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3，(SEQ ID No I) 下游引物5’ -GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’ (SEQ ID No 2)； c、用于對DNA擴增產物的片斷進行基因型鑒定的引物序列，包括rs6677604標記的CFHRl基因型鑒定的引物序列，其序列如SEQ ID No 3所示5’ -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ ID No3)。6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述的人組織樣本為外周血樣本。7.鑒定人組織樣本DNA中CFHRl基因型的方法，其特征在于該方法包括以下步驟 a、從人組織樣本中提取和純化DNA模板； b、利用DNA模板擴增CFHRl基因片段，采用的擴增引物為標記為rs6677604的CFHRl擴增引物對 上游引物5’ -GATGGAAGACACCAGAGCAGAT-3’ (SEQ ID No I)； 下游引物5’ -GAATCCATCAGCTTCTACCATT-3’ (SEQ ID No 2)； c、使用基因型鑒定的引物序列對步驟b得到的CFHRl的基因片段進行擴增，得到的產物測序進行基因型SNP鑒定，如果其中保護性等位基因為純合子標記為AA ;其中如果致病性等位基因為純合子標記為GG ;其中如果保護性/致病性等位基因為雜合子標記為AG ； 所述的基因型鑒定的引物序列包括rs6677604標記的CFHRl基因型鑒定的引物序列5’ -TGAACACATGACTTACATAGTTGCCCTGAGAAAATGCGAG-3’ (SEQ...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張康，彼得肖，
申請(專利權)人：張康，
類型：發明
國別省市：