本發明專利技術為一種豬骨骼肌中特異過表達豬內源IGF1(C1：Ea)基因的安全型表達載體。該載體包含豬內源性序列sk-α-actinPromoter/IGF1(C1:Ea)/sk-α-actin3’UTR/SV40增強子串聯組成的表達盒。本發明專利技術的表達載體在細胞水平上驗證了骨骼肌特異sk-α-actin啟動子在成肌細胞中能高效表達，在具有成肌分化潛能的PEF細胞中僅低水平表達而在其他類型細胞中不表達。本發明專利技術中構建的載體制備轉基因小鼠，通過定量PCR和WesternBlot檢測出轉基因小鼠骨骼肌中IGF1基因的mRNA和蛋白表達水平分別為野生型小鼠的15倍和3.5倍，并且僅在骨骼肌中高效表達。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種安全型骨骼肌特異表達豬類胰島素生長因子I (insulin-like growth factorl, IGF1)基因的過表達載體。
技術介紹
在研究基因功能及轉基因動物生產過程中，人們常常借助真核表達載體來實現， 例如pcDNA3. O系列載體。傳統方法往往通過分子生物學手段將目的基因片段連接到病毒啟動子(如CMV啟動子)或異源性強啟動子下游，以指導外源基因表達。該方法在基因表達及功能的研究中有著極其廣泛的應用，但諸多研究暴露了該手段不足的一面異源性基因序列導入宿主常引起基因組序列的紊亂，內源性基因表達異常，甚至改變宿主固有的特征表型；也常常引起人們對轉基因倫理問題的爭論。此外，病毒啟動子序列或指導質粒DNA復制等原核攏余序列的引入，易引起轉基因安全問題，須經長期的生物安全評價才能投入實際應用，既費時又耗費財力。同時，普遍性過表達外源基因常引起機體生長等的異常。因此，在利用轉基因技術進行動物遺傳改造時，同一物種的內源基因序列，以及組織表達的特異性是保證轉基因動物安全性的基礎。
技術實現思路
本專利技術提供了一種豬內源性骨骼肌特異sk-α -actin啟動子驅動的表達框架，以及含有該表達框架的豬骨骼肌特異過表達豬IGFl基因安全型表達載體。本專利技術所述的豬內源性骨骼肌特異sk- a -actin啟動子驅動IGFl基因的表達盒， 是由依次串聯的 sk_ a-actin 啟動子(sk_ a-actin Promoter)、豬 IGFl (Cl :Ea)基因、 sk- a -actin 3，UTR和SV40增強子組成；該表達盒序列如SEQ ID No. I所示。本專利技術所述骨骼肌特異過表達豬IGFl基因安全型表達載體，含有上述的豬內源性骨骼肌特異sk- a -actin啟動子驅動表達盒，是通過EcoRV酶切位點克隆到轉座子載體 PT2-HB中而獲得；該表達載體的序列如SEQ ID No. 2所示。本專利技術中所述豬內源性骨骼肌特異sk-a-actin啟動子驅動IGFl基因的表達盒是由依次串聯的sk-α-actin啟動子、豬IGFl (Cl :Ea)基因、sk-a-actin 3’UTR和 SV40增強子組成；所述豬內源sk-a -actin啟動子為克隆測序的2602個核苷酸序列；所述 sk- a -actin 3’UTR為克隆測序的751個核苷酸序列；所述豬IGFl (Cl :Ea)基因CDS全長為393個核苷酸序列，具有GENBANK號為匪214256. I的自5'端第13 — 405位核苷酸序列；所述SV40增強子為242個核苷酸序列，從pGL3-C0ntr0l載體自+1第2201-2442位核苷酸序列克隆獲得。所述表達載體安全性體現在載體表達調控元件及目的基因均克隆自豬內源序列， 以及轉座子載體序列為脊椎動物所特有，表達載體的核苷酸序列見序列表。本專利技術中的骨骼肌特異過表達豬IGFl (Cl Ea)基因的安全型表達載體，在細胞水平上驗證了骨骼肌特異sk-α -actin啟動子在成肌細胞中能高效表達，在具有成肌分化潛能的PEF細胞中僅低水平表達而在其他類型細胞中不表達；本專利技術中構建的載體制備轉基因小鼠，通過定量PCR和Western Blot檢測出轉基因小鼠骨骼肌中IGFl基因的mRNA和蛋白表達水平分別為野生型小鼠的15倍和3. 5倍，并且僅在骨骼肌中高效表達，為制備安全、 骨骼肌特異表達目的基因的轉基因豬模型提供了平臺。附圖說明圖I :PCR 擴增 sk-α-actin Promoter 產物電泳圖2 PCR 擴增 sk- a -actin 3，UTR 產物電泳圖3 :PCR擴增豬IGFl (Cl :Ea) cDNA產物電泳圖4 PCR擴增SV40Enhancer產物電泳圖5 :表達載體元件連接示意圖6 pT2/ a -actin-IGFl質粒酶切產物電泳圖7 pT2/ a -actin-IGFl 質粒圖譜；圖8 pT2/ a -actin- Δ IGF1骨架驅動報告基因GFP在各組細胞中表達；圖9 pIGFl轉基因鼠PCR檢測外源基因；圖10 pIGFl轉基因鼠SOUTHERN BLOT檢測外源基因；圖11 :熒光定量檢測IGFl基因在轉基因小鼠組織器官中的表達；圖12 =Western Blot檢測IGFl基因在轉基因小鼠組織器官中的表達；圖13 =Western Blot檢測IGFl基因在轉基因小鼠骨骼肌中的表達。具體實施方式下述實施例中提到的實驗方法，如無特別說明均為常規方法。實施例I、骨骼肌特異表達豬IGFl載體的構建I、特異表達載體基本構件的獲得(I)豬 sk- a -actin Promoter 特異片段的制備以長白豬基因組DNA為模板,按表I中列舉的擴增sk-α-actin Promoter的引物擴增骨骼肌特異sk-α-actin啟動子片段。反應體系為50 μ 1，5 μ L 10XBuffer、4 μ L2.5mM dNTP> IuL 20 μ M 引物 sk-a-actin Promoter F> I μ L 20 μ M 引物 sk-a-actin Promoter R (引物序列見表1)、0· 5 μ L5 U/μ L高保真LA Tag聚合酶，2 μ I長白豬基因組 DNA模板，加超純水至50 μ L(高保真酶購自TaKaRa Code =DRO(^A)t5PCR擴增程序95°C 10s， 60°C 3min，循環35次。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖I所示)。PCR產物用QIAGEN瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化(操作步驟見試劑盒說明)，將純化產物連入PCR克隆載體pMD19-T VectorCTaKaRa Code D102A),按要求步驟操作轉化DH5 α 感受態大腸桿菌(購自北京全式金公司，貨號CD201)；菌液涂瓊脂糖凝膠板，于37°C培養箱中培養過夜；挑單菌落接種于液體LB培養基中培養,部分菌液送公司測序(invitrogen北京分公司)。測序結果表明含有sk-a-actin Promoter的重組載體,提取質粒備用。(2)豬sk-a-actin 3’ UTR特異片段的制備以長白豬基因組DNA為模板，按表I中列舉的擴增sk-a -actin 3’ UTR的引物擴增骨骼肌特異 sk-a-actin 3’UTR片段。反應體系為 50 μ 1，5 μ L 10XBuffer、8 μ L 2. 5mMdNTPU μ L 20 μ M 弓I物 sk-α -actin 3，UTR FU μ L 20 μ M 弓I物 sk-α -actin 3，UTR R(序列見表I)、O. 5 μ L5U/ μ L高保真LA Tag聚合酶，2 μ I長白豬基因組DNA模板，加超純水至 50 μ L (高保真酶購自 TaKaRaCode :DR002A)。PCR 擴增程序95°C 10s, 60 °C lmin，循環 35 次。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖2所示)。PCR產物用QIAGEN瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化(操作步驟見試劑盒說明)，將純化產物連入PCR克隆載體pMD19-T VectorCTaKaRa Code D102A),按要求步驟操作轉本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種豬內源性骨骼肌特異sk?α?actin啟動子驅動IGF1基因的表達盒，是由依次串聯的sk?α?actin啟動子、豬IGF1基因、sk?α?actin?3’UTR和SV40增強子組成；其序列如SEQ?ID?No.1所示。
【技術特征摘要】
1.一種豬內源性骨骼肌特異sk-α -actin啟動子驅動IGFl基因的表達盒，是由依次串聯的sk-a -actin啟動子、豬IGFl基因、sk_ a -actin 3，UTR和SV40增強子組成；其序列如SEQ ID No. I所示。2.ー種骨骼肌特異過表達豬IGFl基因安全型表達載體，其特征在于...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李奎，宋成義，吳晗，鞠輝明，白立景，
申請(專利權)人：中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，揚州大學，
類型：發明
國別省市：
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