一種高密度高產(chǎn)脂率培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)屬于單細(xì)胞油脂及生物柴油生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種同步式提高產(chǎn)油微藻的生物量和產(chǎn)脂量的方法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的產(chǎn)油微藻，培養(yǎng)至添加有碳源和/或氮源的無(wú)菌添加液的液體培養(yǎng)基中，在溫度為18-35℃，轉(zhuǎn)速為100-200rpm，光照強(qiáng)度為0-150μmol?m-2s-1連續(xù)光照的搖床中振蕩培養(yǎng)6-40天。其中，添加有碳源和/或氮源的添加液的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)程中再次添加無(wú)菌添加液。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)將產(chǎn)油微藻的生長(zhǎng)過(guò)程和產(chǎn)脂過(guò)程通過(guò)交替、循環(huán)的控制模式進(jìn)行技術(shù)集成，既能提高藻細(xì)胞濃度，同時(shí)又能高效產(chǎn)脂，一舉兩得。無(wú)需更換培養(yǎng)基組合物，無(wú)需全營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)料分批供應(yīng)，無(wú)需實(shí)時(shí)計(jì)算調(diào)整養(yǎng)料流加速率，不但操作簡(jiǎn)單，而且大大地降低了生產(chǎn)成本。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種高密度高產(chǎn)脂率培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法
本專(zhuān)利技術(shù)屬于單細(xì)胞油脂及生物柴油生產(chǎn)
，特別涉及一種同步式提高產(chǎn)油微藻的生物量和產(chǎn)脂量的方法。
技術(shù)介紹
產(chǎn)油微藻資源豐富，能在多種培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，光合作用效率高，生物量高，生長(zhǎng)繁殖快，生長(zhǎng)周期短，自身合成油脂的能力強(qiáng)，因而被許多學(xué)者認(rèn)為是制備單細(xì)胞油脂及生物柴油的最佳原料之一。微藻油脂通過(guò)與低碳醇進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)可生產(chǎn)生物柴油，利用微藻生產(chǎn)生物柴油，對(duì)緩解人類(lèi)面臨的能源短缺和環(huán)境污染有著巨大的潛力，同時(shí)對(duì)減少生產(chǎn)生活中對(duì)化石能源的依賴(lài)、保證國(guó)家能源安全具有深遠(yuǎn)意義。微藻油脂通過(guò)與多碳醇進(jìn)行酯交換反應(yīng)，可用于生產(chǎn)可生物降解的潤(rùn)滑油、溶劑油、油漆和油墨溶劑、表面活性劑、粘接劑等產(chǎn)品，高值化潛力大。部分微藻油脂含有多不飽和脂肪酸，是生產(chǎn)具有高附加值單細(xì)胞油脂的重要原料。然而利用微藻生產(chǎn)單細(xì)胞油脂及生物柴油存在一個(gè)較大的問(wèn)題就是在培養(yǎng)過(guò)程中，藻細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)脂不同步。藻體增殖與油脂合成間存在著競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，一般產(chǎn)脂微藻在正常的生長(zhǎng)環(huán)境條件下，細(xì)胞內(nèi)累積較少的脂類(lèi)。在不利于生長(zhǎng)繁殖的環(huán)境條件下，才進(jìn)入產(chǎn)油模式，細(xì)胞內(nèi)累積較多的脂類(lèi)和其他抗逆活性物質(zhì)，以維持種群生存。為了解決這些問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)藻細(xì)胞生長(zhǎng)模式與產(chǎn)油模式的可控調(diào)變，已經(jīng)使用了養(yǎng)料分批供應(yīng)培養(yǎng)技術(shù)或更換培養(yǎng)基組合物的方法。然而，這些技術(shù)和方法仍有局限性，控制錯(cuò)綜復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)非常麻煩而且容易出錯(cuò)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單的同步式提高產(chǎn)油微藻生物量和產(chǎn)脂量的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專(zhuān)利技術(shù)采用的技術(shù)方案為：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的產(chǎn)油微藻，培養(yǎng)至添加有碳源和/或氮源的無(wú)菌添加液的液體培養(yǎng)基中，在溫度為18-35℃，轉(zhuǎn)速為100-200rpm，光照強(qiáng)度為0-150μmolm-2s-1連續(xù)光照的搖床中振蕩培養(yǎng)6-40天，直至藻液中其他營(yíng)養(yǎng)元素如磷、硫、鎂等耗盡(取培養(yǎng)液采用離子色譜法測(cè)定營(yíng)養(yǎng)元素殘留量)，培養(yǎng)結(jié)束；其中，添加有碳源和/或氮源的添加液的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)程中再次添加無(wú)菌添加液。所述再次添加無(wú)菌添加液時(shí)添加碳源和氮源的添加液或碳源添加液兩種模式，兩種添加模式交替進(jìn)行，直至培養(yǎng)至再添加碳、氮源對(duì)提高生物量和產(chǎn)脂量效果已不明顯時(shí)結(jié)束添加。所述每種添加模式的間隔為2-5天。所述碳源為無(wú)機(jī)碳源和或有機(jī)碳源；所述無(wú)機(jī)碳源為二氧化碳、碳酸鹽和/或碳酸氫鹽；有機(jī)碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乙醇和/或醋酸鹽。所述氮源為無(wú)機(jī)氮源和/或有機(jī)氮源；其中無(wú)機(jī)氮源為硝酸鹽、銨鹽和/或氨水；機(jī)氮源為尿素、酵母粉和/或蛋白胨。所述產(chǎn)油微藻為脂含量達(dá)到細(xì)胞干重8％以上的可培養(yǎng)微藻株系。本專(zhuān)利技術(shù)原理是：藻體增殖與油脂合成間存在著競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，一般產(chǎn)脂微藻是在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中氮素耗盡并且有過(guò)量碳素用于脂類(lèi)合成時(shí)，才能在細(xì)胞內(nèi)累積較多的脂類(lèi)。需要在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)期切斷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氮的供應(yīng)，這樣就能控制藻類(lèi)進(jìn)入產(chǎn)油模式。不過(guò)，這也同時(shí)減緩了藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致死亡，需要在適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)脂期恢復(fù)營(yíng)業(yè)物質(zhì)氮的供應(yīng)，只要找準(zhǔn)這個(gè)量，控制藻株處于間歇式氮缺乏和持續(xù)碳素供應(yīng)狀態(tài)，就可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)油微藻的生長(zhǎng)與產(chǎn)脂同步進(jìn)行。本專(zhuān)利技術(shù)所具有的優(yōu)點(diǎn)：本專(zhuān)利技術(shù)將產(chǎn)油微藻的生長(zhǎng)過(guò)程和產(chǎn)脂過(guò)程通過(guò)交替、循環(huán)的控制模式進(jìn)行技術(shù)集成，既能提高藻細(xì)胞濃度，同時(shí)又能高效產(chǎn)脂，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專(zhuān)利技術(shù)提供的方法操作簡(jiǎn)單可行，無(wú)需更換培養(yǎng)基組合物，無(wú)需全營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)料分批供應(yīng)，無(wú)需實(shí)時(shí)計(jì)算調(diào)整養(yǎng)料流加速率，添加液成本低廉制備簡(jiǎn)單，從而大大地降低了生產(chǎn)成本。附圖說(shuō)明圖1是本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例所提供的本專(zhuān)利技術(shù)技術(shù)方案流程示意圖。本專(zhuān)利技術(shù)目的、功能及優(yōu)點(diǎn)將結(jié)合實(shí)施例，參照附圖做進(jìn)一步說(shuō)明。具體實(shí)施方式如圖1所示，本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例提供的技術(shù)方案流程示意圖。具體而言，本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于以簡(jiǎn)單易操作的流程實(shí)現(xiàn)同步式提高產(chǎn)油微藻生物量和產(chǎn)脂量，包括以下步驟：(1)選取合適的碳源和氮源，分別制成添加液，高壓蒸汽滅菌或過(guò)濾滅菌；碳源既包括無(wú)機(jī)碳源如二氧化碳、碳酸鹽和/或碳酸氫鹽，也包括有機(jī)碳源如葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乙醇和/或醋酸鹽。氮源既包括無(wú)機(jī)氮源如硝酸鹽、銨鹽和/或氨水，也包括有機(jī)氮源如尿素、酵母粉和/或蛋白胨。(2)取產(chǎn)油微藻在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過(guò)向藻液中加入步驟(1)所述的碳添加液和氮添加液，控制藻細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)模式；通過(guò)向藻液中加入步驟(1)所述的碳添加液，控制藻細(xì)胞進(jìn)入產(chǎn)油模式；所述的向藻液中加入碳、氮添加液，添加方式是一次性添加；添加間隔以2-5天為宜，添加量以加入的碳源和氮源在添加間隔期間能夠被藻細(xì)胞完全消耗為宜，添加次數(shù)以藻細(xì)胞的碳、氮實(shí)際總需量除以每次的添加量換算而得。(3)步驟(2)所述的兩種添加模式交替進(jìn)行，直至藻液中其他營(yíng)養(yǎng)元素如磷、硫、鎂等耗盡，培養(yǎng)結(jié)束，采收藻細(xì)胞破壁提脂。此時(shí)可同時(shí)獲得最大生物量和最大產(chǎn)脂量。所述的至藻液中其他營(yíng)養(yǎng)元素如磷、硫、鎂等耗盡時(shí)培養(yǎng)結(jié)束，是指再添加碳、氮源對(duì)提高生物量和產(chǎn)脂量效果已不明顯，在藻細(xì)胞密度達(dá)到最高且培養(yǎng)液內(nèi)外加碳源被完全消耗時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。實(shí)施例1(1)選取葡萄糖作為碳源，硝酸鉀作為氮源，配制成高濃度的無(wú)菌添加液。(2)取產(chǎn)油微藻小球藻(Chlorellakessleri)在液體培養(yǎng)基中暗異養(yǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為Kuhl培養(yǎng)基，配方：10g/L葡萄糖、1g/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9.3mg/LEDTA、6.9mg/L七水硫酸亞鐵、14.7mg/L二水氯化鈣、0.29mg/L七水硫酸鋅、0.17mg/L一水硫酸錳、0.06mg/L硼酸、0.002mg/L五水硫酸銅、0.012mg/L四水鉬酸銨，pH6.5。藻種按10％(體積比)接種量，接種到含100ml無(wú)菌Kuhl培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在溫度為25□C，連續(xù)黑暗，轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)。(3)培養(yǎng)4天后，在無(wú)菌條件下，向培養(yǎng)液內(nèi)加入葡萄糖至終濃度20g/L，繼續(xù)培養(yǎng)5天后，向培養(yǎng)液內(nèi)加入葡萄糖至終濃度20g/L，硝酸鉀至終濃度為1g/L，再繼續(xù)培養(yǎng)5天后，培養(yǎng)結(jié)束，取樣測(cè)定生物量和產(chǎn)脂量。生物量采用干重法測(cè)定(取5ml藻懸液于室溫3000rpm離心5min，棄去上清液。藻細(xì)胞沉淀用蒸餾水洗2次，然后過(guò)濾到WhatmanGF/C濾紙上，置80℃烘箱內(nèi)烘至恒重后稱(chēng)重)，測(cè)得生物量濃度高達(dá)18g/L；脂含量通過(guò)氣相色譜(GC)測(cè)定(色譜條件為：DB-23毛細(xì)管氣相色譜柱30m×0.25mm×0.25μm；氮?dú)鉃檩d氣；采用分流模式，進(jìn)樣體積為1μl；進(jìn)樣口溫度為250℃；FID檢測(cè)器溫度為260℃；柱溫箱的溫度為以2.5℃/min的升溫速率從140℃升至240℃)，測(cè)定脂含量高達(dá)細(xì)胞干重的48％。實(shí)施例2(1)選取葡萄糖作為碳源，硝酸鉀作為氮源，配制成高濃度的無(wú)菌添加液。(2)取產(chǎn)油微藻小球藻(Chlorellakessleri)在液體培養(yǎng)基中光異養(yǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為Kuhl培養(yǎng)基，配方：10g/L葡萄糖、1g/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9.3mg/LEDTA、6.9mg/L七水硫酸亞鐵、14.7mg/L二水氯化鈣、0.29mg/L七水硫酸鋅、0.1本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種高密度高產(chǎn)脂率培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的產(chǎn)油微藻，培養(yǎng)至添加有碳源和/或氮源的無(wú)菌添加液的液體培養(yǎng)基中，在溫度為18?35℃，轉(zhuǎn)速為100?200rpm，光照強(qiáng)度為0?150μmol?m?2s?1連續(xù)光照的搖床中振蕩培養(yǎng)6?40天。其中，添加有碳源和/或氮源的添加液的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)程中再次添加無(wú)菌添加液。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種高密度高產(chǎn)脂率培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的產(chǎn)油微藻小球藻Chlorellakessleri，培養(yǎng)至添加有碳源和氮源的無(wú)菌添加液的液體培養(yǎng)基中，在溫度為18-35℃，轉(zhuǎn)速為100-200rpm，光照強(qiáng)度為0-150μmolm-2s-1連續(xù)光照的搖床中振蕩培養(yǎng)6-40天；其中，添加有碳源和氮源的添加液的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)程中再次添加無(wú)菌添加液；再次添加無(wú)菌添加液時(shí)添加碳源添加液或碳源和...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王艷，秦松，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：