本發明專利技術公開了一種用于腸癌診斷的一組miRNA的檢測方法和應用，該組miRNA是一組miR-129-3p、miR-767-3p、miR-877*的生物標志物，其miRNA序列分別如SEQ?ID?NO.1，NO.2、NO.3所示；其檢測方法，包括：1)收集人血清樣本；2)提取血清中總RNA；3)對生物標志物進行反轉錄和實時定量PCR反應，以U6?snRNA作為內參，計算每個生物標志物的PCR相對定量值；4)根據每個生物標志物的PCR相對定量值計算P值，當P＞0.6621時，認為是腸癌樣本，P＜0.6621時，認為是非腸癌樣本。利用該組生物標志物可簡單、快捷地進行腸癌檢測、診斷，以便更好的治療。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種作為生物標志物的內源性非編碼小RNA(MicroRNA，miRNA)，特別是涉及用于腸癌診斷的一組miRNA的檢測方法和應用。
技術介紹
大腸癌包括直腸癌和結腸癌，是常見惡性腫瘤之一。美國、加拿大等西歐及北美發達國家是發病率最高的國家，發病率高達35 50/10萬，其發病率及病死率在惡性腫瘤中僅次于肺癌而居第2位。我國的有關資料顯示，大腸癌發病率為15. 7/10萬人口，占惡性腫瘤的第4 6位，而且有逐漸增加的趨勢。我國2005年結直腸癌發病數和死亡數分別達17.2萬和9. 9萬，已超過美國。本病的預后取決于能否早期診斷與手術根治。然而由于早期大腸癌多無癥狀，大多數患者確診時，已屆晚期，大腸癌根治術后5年生存率僅為50. 21%。 癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen, CEA)是最早發現的大腸癌血清腫瘤標志物,但CEA在大多數惡性腫瘤血清中均有不同程度升高，特異性較低，對大腸癌的早期診斷價值不高。因此尋找理想的特異性強、敏感性高的腫瘤標志物是提高防治的重要手段之一。MicroRNA(miRNA)是在動植物體內發現的長度約為21 25個核苷酸的非編碼RNA分子，主要通過切斷降解和翻譯抑制來完成它對靶基因的負調控。由于它的序列、結構、豐度和表達方式的多樣性，使其在真核基因表達調控中有著廣泛的作用。作為人類腫瘤信號通路積極的參與者，miRNA不僅扮演著原癌基因和抑癌基因的角色，與腫瘤的轉移凋亡也有關聯。由于不同的腫瘤顯示出特異性的miRNA表達譜，miRNA在福爾馬林固定的組織中有很高的穩定性，所以越來越多的科學家提出miRNA在血清和血漿中也能有穩定的表達，并可以作為潛在的新型腫瘤標志物。單個miRNA能夠影響數百個蛋白質表達，21-25個核苷酸的長度也決定了 miRNA沒有復雜的結構與修飾過程，這些特點都預示了 miRNA作為生物學標志的優越性。已有研究發現，miR-141在包括人前列腺癌在內的上皮細胞性腫瘤患者血清中有明顯的表達上調，提示miR-141可以作為判斷腫瘤類型的生物學標志。缺乏明顯臨床癥狀及有效生物學標志的卵巢癌患者也可以用血清miRNA檢測來提高早期診斷及早期治療的可能性。科學家們發現并證實了 miR-21、92、93、126和29a在腫瘤血清樣本中有明顯的過量表達，而miR-155、127及99b的表達卻明顯降低。此外在彌漫性大B細胞淋巴瘤血清中miR-21的表達明顯增高，增高的miR-21還暗示了較好的無復發生存率。這一結果顯示，檢驗miRNA的特異性表達不僅有助于腫瘤的早期診斷，還可用于病人的預后判斷。這些研究都充分證實，血清及血漿miRNA的測定是一個檢測癌癥生物學標志物很有前途的領域。因而，開發一種可輔助腸癌診斷的miRNA生物標志物，可以建立一種更敏感，更精確的早期確診乃至早期治療腸癌的方法，具有廣泛的科研價值和臨床應用前景。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供用于腸癌診斷的一組miRNA的檢測方法和應用，尤其是涉及一組用于檢測腸癌的miRNA生物標志物(miR-129-3p、miR-767_3p和miR-877*)、方法及其應用。利用該組生物標志物可以簡單、快捷地進行腸癌檢測和診斷，以便更好的治療。為解決上述技術問題，本專利技術的一組用于腸癌檢測的miRNA生物標志物，是分別如 SEQ IDNO. UNO. 2,NO. 3 所示 miRNA 序列的 miR-129-3p、miR-767_3p 和 miR-877*。該組miRNA在腸癌患者血清中特異性表達上調。該組生物標志物還可以應用于腸癌的診斷。另外，本專利技術還提供了一種利用上述生物標志物組進行腸癌檢測的方法，具體包括以下步驟(I)收集人血清樣本； (2)提取血清中總RNA (包含miRNA);(3)對miR-129-3p、miR-767_3p和miR-877*生物標志物進行反轉錄和實時定量PCR(RT-PCR)，并計算每個生物標志物的PCR相對定量值；(4)根據每個生物標志物的PCR相對定量值計算P值(腸癌可能概率)，當P值大于O. 6621時,則認為是腸癌樣本,小于O. 6621時,則認為是非腸癌樣本。其中，步驟⑴收集人血清樣本的具體操作為將收集的血液樣本放入不含EDTA (乙二胺四乙酸)的試管中，靜置凝固后，取上清，在4°C下600g 900g離心5 15分鐘后，再取上清并在4°C下12000g 16000g離心5 15分鐘，再取上清即得。步驟(2)中的總RNA抽提，可按照商業化的RNA抽提試劑盒進行操作，并測量RNA的濃度。步驟(3)中的反轉錄可按照商業化的反轉錄試劑盒進行；RT_PCR反應也可按照商業化RT-PCR反應試劑盒進行操作，其中，RT-PCR反應中，以U6snRNA作為內參，并自行設計U6snRNA的引物，以及使用2_ΔΜ公式來計算每個生物標志物的PCR相對定量值，式中Δ Ct=Otiawstf-Ctu6, Ct是域值循環數，Ot 是每個生物標志物的Ct值，Ctu6是U6snRNA的Ct值。反轉錄反應條件為37°C I小時，95°C 5分鐘。RT-PCR反應中U6 snRNA的引物序列設計為 TTCGTGAAGCGTTCCATATTTT(SEQ ID NO. 4 所示)，miR-129_3p 生物標志物的引物序列為AAGCCCTTACCCCAAAAAGC(SEQ ID NO. 5所示)，miR-767_3p生物標志物的引物序列為TCTGCTCATACCCCATGGTTTCT (SEQ ID NO. 6所示)，miR-877*生物標志物的引物序列為TCCTCTTCTCCCTCCTCCCAG(SEQ ID NO. 7 所示)，其 RT-PCR 反應條件為 95°C 15 分鐘，然后進行循環，循環條件為94°C 15秒，550C 30秒，70°C 34秒，共40個循環。步驟(4)中的P值(腸癌可能概率)具體計算方法為根據Logistic回歸方程式Iogit(P) = -I. 4867-8. 2881* (miR-129_3p 的 PCR 相對定量值)+87. 1459* (miR-767_3p 的PCR相對定量值)+0. 1681* (miR-877*的PCR相對定量值)計算出Iogit⑵，并根據所得的logit (P)參照表3 (引用自Medcalc軟件使用指南)得出相應的P值。再者，本專利技術還提供一種用于腸癌檢測的生物標志物組檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括常規實時定量PCR試劑(包括Taq酶、dNTP試劑、熒光試劑、PCR緩沖液、DEPC處理水等)，內參U6 snRNA的檢測引物(SEQ ID NO. 4所示)，miR-129-3p、miR-767_3p、miR-877*的檢測引物(SEQ ID NO. 5、N0. 6和NO. 7所示)。其中，該檢測試劑盒的操作方法可參照利用上述生物標志物組進行腸癌檢測的方法進行。本專利技術的實驗數據顯示腫瘤和正常樣本都具有特異性的血清miRNA表達譜。本專利技術中的miR-129-3p、miR-767-3p和miR-877*在正常人和腸癌患者血清中存在差異表達，在腸癌血清中有顯著的表達上調。另外，本專利技術中生物標志物組的P值(腸癌可本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一組用于腸癌檢測的miRNA生物標志物，其特征在于：所述miRNA生物標志物是分別如SEQ？ID？NO.1、NO.2、NO.3所示miRNA序列的miR？129？3p、miR？767？3p和miR？877*。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉寒梢，孟憲欣，張偉，張春秀，肖華勝，
申請(專利權)人：上海生物芯片有限公司，上海伯豪生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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