本發明專利技術公開了一種用于II、III期結直腸癌診斷及預后的微小核糖核酸組合及其應用。所述miRNA組合包括：miR-17-3p、miR-106a和miR-145中的任意二到三種。所述試劑盒包括上述miRNA的TaqMan探針組合。在本發明專利技術中，血清較易獲得，無需其它組織，屬于無創性檢查；血清miRNA反映的是機體整體的病理、生理情況，以其作為診斷標志物可以提高檢測的準確性；所述試劑盒簡化了TaqMan探針庫，減少制作成本和生產時間，增加了針對性和實用性，提高了檢測的靈敏度和特異性；所述組合、方法、試劑盒不僅能夠用于結直腸癌的早期檢測，還能用于II、III期結直腸癌生存期和化療效益的預測。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物
，涉及一種用于II、III期結直腸癌診斷及預后的微小 核糖核酸組合及其應用。
技術介紹
在我國，結直腸癌作為第三大腫瘤，其發病率及死亡率近年來逐年上升。目前在結 直腸癌臨床工作中尚有許多亟待解決的問題。第一，尚缺乏有效的用于疾病早期診斷的非 侵入性生物標志物。大便潛血試驗及結腸鏡檢查是目前較為公認的早期診斷方法，多項大 樣本臨床研宄資料顯示，在50歲以上的人群中進行篩查可降低結直腸癌發病率及死亡率。 大便潛血檢查因操作方便、成本低廉得到廣泛應用，但低靈敏度和特異度使其臨床價值有 限。結腸鏡檢查是目前早期診斷結直腸癌的金標準，但操作難度大、花費高及并發癥風險導 致病人依從性差，難以成為人群篩查的常規手段。第二，尚缺乏有效的預后判斷及化療療效 評價指標。目前臨床上主要依據基于臨床病理指標（如腫瘤大小、淋巴結轉移數目、遠處轉 移、組織分級等）的TNM分期作為疾病預后的判斷及指導臨床治療，但根據此分期判斷患者 預后存在較大的異質性，亦不能預測腫瘤患者對化療的反應。 診斷技術的不斷提高使新發結直腸癌病例中非轉移性疾病的比例大大增加，一 項來自美國的統計顯示每年新發結直腸癌患者中IIJII期病人比例超過一半，對于這部分 患者，外科手術及輔助化療是主要治療手段。對于淋巴結陽性的局部進展期病人（AJCC III 期），有多項大樣本臨床試驗證明根治性手術以及輔助化療可顯著提高生存，已成為標準治 療。一般認為，II期患者根治性手術后是治愈的，術后是否進行輔助化療仍存在爭議，目前 認為患者存在高危因素（如T4,脈管侵犯，組織學分化差，梗阻，穿孔等）預示較差的預后并 且可能從化療中獲益，但是這些臨床病理指標的明確意義尚未得到大樣本資料驗證。研宄 表明II、111期結直腸癌患者經過標準治療后仍有20% - 30%出現復發，其中40 - 50%復發 發生在原發灶切除后一年內，80 %復發發生在原發灶切除三年內，復發后5年生存率低于 1 %。因此，對于這部分病人，尋找有效的預后以及復發預測指標顯得尤為重要。 微小核糖核酸（microRNA，miRNA)是一類長約19至23個核苷酸的非編碼單鏈小 核糖核酸分子，其主要功能是參與基因轉錄后水平調控。miRNA通過與靶mRNA 3'端非 翻譯序列完全或部分互補結合，導致靶mRNA降解或轉錄后翻譯抑制從而調控靶基因的表 達。miRNA參與1/3人類蛋白編碼基因調控，它與多種生理活動有關，如生長發育、細胞增 殖、細胞凋亡、細胞分化等；也與許多疾病的發生發展密切相關，如糖尿病、心血管疾病、月中 瘤等。最近的研宄顯示 ，miRNA在腫瘤發生、發展過程中發揮抑癌基因或癌基因樣作用。 已證實，腫瘤組織和腫瘤細胞中的某些miRNA表達水平發生了變化，相對于正常組織，一些 miRNA表達量顯著上升或下降。許多癌組織如肺癌、乳腺癌和食管癌等組織都有若干組織特 異性miRNA的表達，提示miRNA有腫瘤組織特異性。另外，miRNA的表達也與腫瘤分化程度 以及預后有關。大量的研宄結果揭示，miRNA可作為新的腫瘤標志物，且為腫瘤的基因治療 提供新靶點。但組織標本取材屬創傷性檢出，且無法實現腫瘤的早期診斷和預后判斷。最 近報道顯示，人血清/血漿中也存在豐富、穩定的miRNA，一些腫瘤包括非小細胞肺癌、結直 腸癌、前列腺癌、卵巢癌和胰腺癌患者血清中miRNA表達譜與正常人有顯著差異，均有各自 特異的表達譜。 目前尚沒有利用無創傷性、取材方便的血液標本檢測判斷與結直腸癌分期相關和 預后相關的特異性miRNA組合及檢測試劑盒。
技術實現思路
本專利技術的目的就在于通過研宄II、111結直腸癌患者血清miRNA的特異性變化，篩 選出一組與正常人群差異表達并且與腫瘤負荷密切相關的血清miRNA，并利用這些miRNA 的TaqMan探針制備出適用于臨床診療用途的試劑盒，為結直腸癌分期診斷及術后預后提 供特異性的中間結果以及迅速的無創傷性檢測手段。 以下是對本專利技術的
技術實現思路
與技術方案的詳細描述： -種用于檢測II、III期結直腸癌的miRNA組合，該miRNA組合包括下列miRNA : miR - 17、miR - 106a、miR - 145 中的一種或多種；優選由 miR - 17、miR - 106a 和 miR - 145 中的任意兩種或三種組成；進一步優選由miR - 17和miR - 106a組成。 上述miRNA組合的篩選方法包括以下步驟（見圖1): (1)分別收集20例手術前II、111結直腸癌患者混合血清，20例手術后II、111結直腸 癌患者混合血清，20例年齡與性別匹配的正常人混合血清，提取總RNA ; (2)采用低密度芯片技術（TaqMan low density Array technology)，對上述總 RNA中成熟miRNA進行檢測，篩選出3組樣本間表達差異的miRNA ; (3)用實時熒光定量PCR方法（TaqMan探針法）對上述標本進行逐個檢測，從低密 度芯片方法初篩出的miRNA中復篩出表達差異顯著miRNA ; (4)進一步用定量PCR方法對大批量標本進行逐個驗證，篩選出穩定的表達差異 顯著的一組miRNA。 具體來說，上述篩選方法包括以下步驟：（1)分別收集正常人及II、m結直腸癌患 者手術前后的混合血清，提取總RNA ; (2)運用低密度芯片技術對上述RNA進行檢測，初篩出 手術前后及與非癌對照組表達差異顯著的一些miRNA ; (3)將抽提的RNA逆轉錄為cDNA，采 用熒光定量PCR (TaqMan探針法）對初篩出的miRNA進行復篩和驗證，挑選出手術前后及與 非癌對照組穩定、特異表達的一組miRNA。 本專利技術使用的檢測方法可以選自：RT - PCR方法、低密度芯片技術（TaqMan low density Array technology)、Real - time PCR 方法中的一種或幾種。例如，血清中 miRNA 分子的檢測方法包括以下步驟： (1)使用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取血清總RNA ; (2)通過RNA逆轉錄反應得到cDNA ; (3)利用TaqMan探針法進行PCR反應； (4)進行PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳； (5)EB染色后在紫外燈下觀察結果。 本專利技術還提供了一種用于結直腸癌早期診斷和/或預后診斷的miRNA TaqMan探 針組合物，其包括miR-17、miR-106a和miR-145中的任意兩種或三種miRNA的TaqMan探 針，優選由miR -17和miR - 106a兩種miRNA的TaqMan探針組成，或由miR - 17、miR - 106a 和miR - 145三種miRNA的TaqMan探針組成，各探針序列進一步優選如下表所示： 此外，本專利技術還提供一種用于結直腸癌診斷和/或預后的試劑盒。 在本專利技術的一個具體實施方案中，上述試劑盒包括Taq酶和dNTP，氯化鎂、 10XPCR緩沖液（不含Mg 2+)和包括miR - 17、miR - 106a和miR - 145中任意一種或多種 miRNA的TaqMan探針（ABI公司提供，專用于miRNA熒光定量）。 上述試劑盒可以本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于檢測II、III期結直腸癌的miRNA組合，其特征在于該miRNA組合包括下列miRNA：miR‐17、miR‐106a、miR‐145中的一種或多種。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張辰宇，巴一，曾科，李佳璐，陳熹，
申請(專利權)人：南京大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32
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