一種磷酸修飾熒光團的核苷酸分子測序方法技術

本發明專利技術涉及一種多核苷酸測序方法，更具體的說，是一種磷酸修飾有熒光團的混合核苷酸分子進行測序的方法。更進一步，本發明專利技術公開了將熒光切換測序和混合核苷酸分子測序聯合使用的方法。其特殊的信號獲得方式和獲得效率，使得其在基因測序方向有很大的應用前景。

【技術實現步驟摘要】
一種磷酸修飾熒光團的核苷酸分子測序方法
本專利技術涉及一種高通量測序方法，屬于基因測序領域。背景介紹高通量測序儀是近幾年高速發展的技術。高通量測序，相較于傳統桑格測序，最大的優勢是可以同時讀出海量的序列信息。雖然準確度不如傳統測序方法，但由于海量數據分析，便可得出超出序列本身的信息，如基因表達量、拷貝數變異。當今主流測序儀均使用SBS(sequencingbysynthesis邊合成邊測序)方法，如solexa/illumina、454、iontorrent等。這些測序儀的結構相似，都包括流體系統，光學系統，和芯片系統。測序反應在芯片內發生。測序過程也很相似，都包括：將反應液通入芯片，發生SBS反應，采集信號，沖洗，進行下一輪。這樣的周期性過程。隨著周期的增多，測出連續的單堿基非兼并序列信息(如ACTGACTG)。然而，高通量測序儀無法徹底消除測序錯誤。測序錯誤可能來源于：反應偶然錯誤或累積錯誤，信號采集錯誤，信號矯正帶來的誤差等等。現有測序儀中，這些化學或光學、軟件上帶來的錯誤，或成為噪聲，在單個讀出位點無法被識別。只能通過深度測序，利用同一序列在不同位點的多次讀取進行消除。更準確的讀出是高通量測序發展的重要方向。但現有技術對準確度的優化，多集中在優化化學反應本身以及后續圖像信號處理上，沒有從測序邏輯上進行革新。本專利技術涉及一種多核苷酸測序方法，更具體的說，是一種磷酸修飾有熒光團的混合核苷酸分子進行測序的方法。同時，本專利技術涉及一種熒光切換性質的熒光團進行測序的方法。熒光切換性質的熒光團進行測序使用末端磷酸標記的核苷酸底物。熒光切換性質的熒光團的底物是通式為：在5’多磷酸末端或中間修飾有一種具有熒光切換性質的熒光團。其特點是，在4，5，6，或更多磷酸的脫氧核糖核苷酸(包括A，C，G，T，U以及其他核苷酸)的末端磷酸上或者中間磷酸上修飾有熒光切換的熒光團，并且在堿基和3’羥基上沒有標記。這個熒光團在修飾在磷酸上時與磷酸脫離時的吸收光譜與/或發射光譜不同。測序又連續的、相似的周期(cycle)構成。每個周期內包含進樣，反應和信號采集，和清洗未反應的反應物分子等步驟構成。在前人報道的方法中，每次進入一個堿基的底物分子，若不正確配對，則無反應發生；若正確配對，則聚合酶將底物分子連接至3‘尾端，并且釋放出多磷酸修飾的熒光分子，并且熒光光譜發生變化。若可以與homopolymer連續配對，則有成倍數的光譜改變。在實際應用中，傾向使用被標記在末端磷酸上無吸收，釋放狀態為高量子產率的熒光切換性質熒光團作為底物分子的修飾標記，例如甲基熒光素，含鹵代的甲基熒光素，DDAO，resorufin，CN104844674中涉及的熒光分子等等。四種底物分子可以標記有不同的熒光分子。測序過程由ACGTACGT…或任意的循環或不循環進樣過程進樣，在有限的周期內含有底物分子的反應液進行測序反應。通過每個cycle得到的延伸信息，得到DNA序列。
技術實現思路
本專利技術涉及一種多核苷酸測序方法，更具體的說，是一種磷酸修飾有熒光團的混合核苷酸分子進行測序的方法。利用5’多磷酸末端或中間磷酸修飾有熒光團的核苷酸底物分子進行測序；每輪測序使用一套反應液組，每套反應液組包括兩個反應液，每個反應液包含兩種包含不同堿基的核苷酸；其中一個反應液中的核苷酸可以和待測核苷酸序列上的兩種堿基互補，另一個反應液中的核苷酸可以和待測核酸序列上的另外兩種堿基互補；首先，將待測的核苷酸序列片段固定，通入一套反應液組中的第一個反應液；檢測、記錄熒光信息；然后通入同一套反應液組中的第二個反應液；檢測、記錄熒光信息；兩個反應液循環加入，通過熒光信息獲得待測核苷酸底物的編碼信息。本專利技術所述的反應液，指的是一般意義上的測序反應液。反應液和反應液的間隙，可以進入其它的清洗溶液等輔助溶液。根據優選的技術方案，所述的每個反應液包含兩種不同堿基的核苷酸，可以用兩種不同的熒光團標記，也可以用相同的的熒光團標記。根據優選的技術方案，利用5’多磷酸末端或中間磷酸修飾有具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序；所述的熒光切換性質指的是測序后熒光信號相比測序反應前有明顯改變。根據優選的技術方案，所述的熒光切換性質指的是測序后熒光信號相比測序反應前有明顯增強或者說上升，其可能發射光的頻率會有變化，但是其總體發射光強度或者說某個特定頻段的發射光光強明顯增強。本專利技術涉及一種利用具有熒光切換性質熒光團的核苷酸分子進行測序的方法，其特征在于，利用5’多磷酸末端或中間磷酸修飾有具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序；所述的熒光切換性質指的是測序后熒光信號強度相比測序反應前有明顯上升；每輪測序使用一套反應液組，每套反應液組包括兩個反應液，每個反應液包含兩種不同堿基的核苷酸底物分子；其中一個反應液中的核苷酸底物分子可以和待測核苷酸序列上的兩種堿基互補，另一個反應液中的核苷酸底物分子可以和待測核酸序列上的另外兩種堿基互補；首先，將待測的核苷酸序列片段固定在反應室中，然后通入一套反應液組中的一個反應液；使用酶將具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物上面的熒光團釋放，從而導致熒光切換；然后通入同一套反應液組中的第二個反應液；使用酶將具有熒光切換性質的熒光團的核苷酸底物上面的熒光團釋放，從而導致熒光切換；兩個反應液循環加入，通過熒光信息獲得待測核苷酸底物的編碼信息。本專利技術涉及一種利用具有熒光切換性質熒光團的核苷酸分子進行測序的方法，其特征在于，利用5’多磷酸末端或中間磷酸修飾有具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序；所述的熒光切換性質指的是測序后熒光信號強度相比測序反應前有明顯上升；每輪測序使用一套反應液組，每套反應液組至少包括兩個反應液，每個反應液包含A、G、C、T核苷酸分子中的至少一種，或者每個反應液包含A、G、C、U核苷酸分子中的至少一種；首先，將待測的核苷酸序列片段固定在反應室中，通入一套反應液組中的一個反應液；檢測、記錄熒光信息；每次通入一個反應液，將同一反應液組中的其它反應液依次通入，并且每次檢測、記錄熒光信息；其中，所述反應液組中，至少有一個反應液包含兩種或者三種不同的核苷酸分子。本專利技術涉及一種利用具有熒光切換性質熒光團的核苷酸分子進行測序的方法，其特征在于，利用5’多磷酸末端或中間磷酸修飾有具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序；所述的熒光切換性質指的是測序后熒光信號強度相比測序反應前有明顯上升；每輪測序使用一套反應液組，每套反應液組至少包括兩個反應液，每個反應液包含A、G、C、T核苷酸分子中的任意一種，或者每個反應液包含A、G、C、U核苷酸分子中的任意一種；首先，將待測的核苷酸序列片段固定在反應室中，通入一套反應液組中的一個反應液；檢測、記錄熒光信息；每次通入一個反應液，將同一反應液組中的其它反應液依次通入，并且每次檢測、記錄熒光信息。本專利技術涉及一種利用具有熒光切換性質熒光團的核苷酸分子進行測序的方法，其特征在于，利用5’多磷酸末端或中間磷酸修飾有具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序；所述的熒光切換性質指的是測序后熒光信號強度相比測序反應前有明顯上升；每輪測序使用一個反應液組，反應液包含A、G、C、T四種核苷酸分子，或者反應液包含A、G、C、U四種核苷酸分本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用核苷酸底物分子進行測序的方法，其特征在于：利用5’多磷酸末端或中間磷酸修飾有熒光團的核苷酸底物分子進行測序；每輪測序使用一套反應液組，每套反應液組包括兩個反應液，每個反應液包含兩種包含不同堿基的核苷酸；其中一個反應液中的核苷酸可以和待測核苷酸序列上的兩種堿基互補，另一個反應液中的核苷酸可以和待測核酸序列上的另外兩種堿基互補；首先，將待測的核苷酸序列片段固定，通入一套反應液組中的第一個反應液；檢測、記錄熒光信息；然后通入同一套反應液組中的第二個反應液；檢測、記錄熒光信息；兩個反應液循環加入，通過熒光信息獲得待測核苷酸底物的編碼信息。

【技術特征摘要】
1.一種利用核苷酸底物分子進行測序的方法，其特征在于：利用5’多磷酸末端或中間磷酸修飾有熒光團的核苷酸底物分子進行測序；每輪測序使用一套反應液組，每套反應液組包括兩個反應液，每個反應液包含兩種包含不同堿基的核苷酸；其中一個反應液中的核苷酸可以和待測核苷酸序列上的兩種堿基互補，另一個反應液中的核苷酸可以和待測核酸序列上的另外兩種堿基互補；首先，將待測的核苷酸序列片段固定，通入一套反應液組中的第一個反應液；檢測、記錄熒光信息；然后通入同一套反應液組中的第二個反應液；檢測、記錄熒光信息；兩個反應液循環加入，通過熒光信息獲得待測核苷酸底物的編碼信息。2.根據權利要求1所述的測序方法，其特征在于，所述的每個反應液包含兩種不同堿基的核苷酸，可以用兩種不同的熒光團標記，也可以用相同的的熒光團標記。3.根據前面任一項權利要求所述的方法，其特征在于，利用5’多磷酸末端或中間磷酸修飾有具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序；所述的熒光切換性質指的是測序后熒光信號相比測序反應前有明顯改變。4.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的熒光切換性質指的是測序后熒光信號相比測序反應前有明顯增強(或者說上升)。5.一種利用具有熒光切換性質熒光團的核苷酸分子進行測序的方法，其特征在于，利用5’多磷酸末端或中間磷酸修飾有具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序；所述的熒光切換性質指的是測序后熒光信號強度相比測序反應前有明顯上升；每輪測序使用一套反應液組，每套反應液組包括兩個反應液，每個反應液包含兩種不同堿基的核苷酸底物分子；其中一個反應液中的核苷酸底物分子可以和待測核苷酸序列上的兩種堿基互補，另一個反應液中的核苷酸底物分子可以和待測核酸序列上的另外兩種堿基互補；首先，將待測的核苷酸序列片段固定在反應室中，然后通入一套反應液組中的一個反應液；使用酶將具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物上面的熒光團釋放，從而導致熒光切換；然后通入同一套反應液組中的第二個反應液；使用酶將具有熒光切換性質的熒光團的核苷酸底物上面的熒光團釋放，從而導致熒光切換；兩個反應液循環加入，通過熒光信息獲得待測核苷酸底物的編碼信息。6.一種利用具有熒光切換性質熒光團的核苷酸分子進行測序的方法，其特征在于，利用5’多磷酸末端或中間磷酸修飾有具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序；所述的熒光切換性質指的是測序后熒光信號強度相比測序反應前有明顯上升；每輪測序使用一套反應液組，每套反應液組至少包括兩個反應液，每個反應液包含A、G、C、T核苷酸分子中的至少一種，或者每個反應液包含A、G、C、U核苷酸分子中的至少一種；首先，將待測的核苷酸序列片段固定在反應室中，通入一套反應液組中的一個反應液；檢測、記錄熒光信息；每次通入一個反應液，將同一反應液組中的其它反應液依次通入，并且每次檢測、記錄熒光信息；其中，所述反應液組中，至少有一個反應液包含兩種或者三種不同的核苷酸分子。7.一種利用具有熒光切換性質熒光團的核苷酸分子進行測序的方法，其特征在于，利用5’多磷酸末端或中間磷酸修飾有具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序；所述的熒光切換性質指的是測序后熒光信號強度相比測序反應前有明顯上升；每輪測序使用一套反應液組，每套反應液組至少包括兩個反應液，每個反應液包含A、G、C、T核苷酸分子中的任意一種，或者每個反應液包含A、G、C、U核苷酸分子中的任意一種；首先，將待測的核苷酸序列片段固定在反應室中，通入一套反應液組中的一個反應液；檢測、記錄熒光信息；每次通入一個反應液，將同一反應液組中的其它反應液依次通入，并且每次檢測、記錄熒光信息。8.一種利用具有熒光切換性質熒光團的核苷酸分子進行測序的方法，其特征在于，利用5’多磷酸末端或中間磷酸修飾有具有熒光切換...

【專利技術屬性】
技術研發人員：黃巖誼，陳子天，段海峰，
申請(專利權)人：北京大學，賽納生物科技北京有限公司，
類型：發明
國別省市：北京,11