通過擴增圓紅冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因組DNA上下游序列，進行生物學信息分析和功能驗證，獲得可有效表達目的基因于圓紅冬孢酵母，并因此能夠用于圓紅冬孢酵母遺傳工程操作和菌株改良的啟動子和終止子。本發明專利技術還涉及包含這些元件的DNA構建體和載體。
【技術實現步驟摘要】
本專利屬于基因工程
，具體涉及圓紅冬孢酵母啟動子、終止子及其用途， 包括基因工程菌株構建所必需的轉化方法等。
技術介紹
微生物是自然界中分布最廣泛的物種之一，具有卓越的生物合成能力，幾乎能合成地球上所有的有機化學品。微生物的種屬多樣性和遺傳多樣性決定了其代謝多樣性。與多細胞生物相比，微生物的代謝途徑雖然相對簡單，但其化合物的生產高效、快捷，并與人類日常生產生活關系密切。做為某一化學品的天然生產菌株或環境治理應用菌株，其特定的生產性能往往并非最優化。如何優化或改變工業菌株的代謝網絡和表達調控網絡，以提高生物基產品的積累速度或定向控制靶產品的質量，是當今生物
研究的熱點和難點。實際上，對微生物油脂代謝過程的理解、開發和利用是否能達到或者超過化學加工水平，也是提高發酵過程經濟性的關鍵。全基因組測序和基因工程技術的進步，為菌株生理學特性的認識和菌株改良提供了比傳統誘變技術更為合理的方法。代謝工程的實質是利用重組DNA技術和其它技術，有目的地改變已有的代謝和表達調控網絡，更好地理解和利用細胞的代謝途徑。代謝工程可以在細胞與分子水平上認識和改造細胞過程，其不僅可以解釋細胞生理生化特性，而且還可賦于出發菌株新的性狀和表型(1)擴大底物利用范圍；( 生產原來不存在的新化合物；C3)增強對環境中毒害物質的降解能力；(4)提高菌體對環境的適應能力；(5)阻斷或降低副產品的生成；(6)代謝產品生產速率和生產性能的提高等(Bailey J Ε. Toward a science ofmetabolic engineering. Science. 1991,252(5013) :1668-1675 ；Aristidou A,Penttila M. Metabolic engineering applications to renewable resource utilization. Curr. Opin.Biotechnol.2000，11(2) :187-198)。圓紅冬孢酵母屬于擔子菌門異宗配合型真菌，是發酵工業中一種極為重要的微生物，可利用源于生物質的己糖和戊糖為原料生產重要的生物基產品微生物油脂， 胞內油脂可達細胞干重的60 %以上(Ratledge C, WynnJ P. The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginousmicroorganisms.Adv. Appl. Microbiol. 2002, 51 :1-51 ；Li Y, Zhao Z, Bai F. High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4infed-batch culture.Enzyme Microb. Technol. 2007,41 (3) :312-317)；工業用酶或藥物合成用酶如磷酸二酯酶、苯丙氨酸角軍氨酶(Hodgins D S. Yeastphenylalanine ammonia-lyase. Purification, properties, and the identification ofcatalytically essential dehydroalanine. J Biol.Chem. 1971,246(9) :2977-2985 ；Gilbert H J, Clarke I N, Gibson R K, et al. Molecular cloning of the phenylalanineammonia lyase gene from Rhodosporidiumtoruloides in Escherichia coli K-12. JBacteriol. 1985,161 (1) :314-320)、D氨基酸氧化酶(Gadda G Negri A,PiloneM S. Reaction of phenylglyoxal with arginine groups in D-amino-acid oxidasefrom Rhodotorula gracilis. J Biol. Chem. 1994,269(27) 17809-17814 ；Liao G J, Lee Y J, Lee Y H, et al. Structure and expression of the D-amino-acid oxidasegene from the yeast Rhodosporidium toruloides. Biotechnol. Appl.Biochem. 1998，27 (Pt 1) :55-61)等；β-胡蘿卜素和胞外多糖；并在污水處理和生物制藥中有較廣泛的應用。實驗結果表明，該菌可同時利用五碳糖和六碳糖為底物，抗逆性好，能直接以玉米秸稈酸水解液為碳源積累油脂，可實現生物質到生物基產品的高效轉化 (李永紅，劉波，孫艷，等.廣譜碳源產油酵母菌的篩選.中國生物工程雜志，2005，25 (12) 39-44)。雖然圓紅冬孢酵母具有優良的工業生產性能，同時，圓紅冬孢酵母來源的蛋白酶異源表達也獲得成功(Pollegioni L，Molla G Campaner S，Cloning，sequencing and expression in Ε.coli of a D—amino acid oxidase cDNA fromRhodotorula gracilis active on cephalosporin C. J Biotechnol. 1997，58(2) 115-123 ；Faulkner J D， Anson J G，Tuite M F，et al. High-level expression of thephenylalanine ammonia lyase-encoding gene from Rhodosporidium toruloidesin Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli using a bifunctionalexpression system. Gene. 1994,143 (1) 13-20)，但圓紅冬孢酵母自身缺乏相應的遺傳操作系統。以圓紅冬孢酵母為宿主菌，無論是基因工程操作還是代謝工程菌株改良，都受到遺傳操作系統的制約，難以進行靶向性的菌株改造。啟動子對于遺傳操作系統來說必不可少。因此，如果要對圓紅冬孢酵母進行遺傳操作，獲得能在圓紅冬孢酵母中起作用的啟動子是該工作的關鍵環節。
技術實現思路
鑒于上述現有技術瓶頸，本專利技術的主要目的是提供可用于在圓紅冬孢酵母中有效表達外源基因，并且可通過遺傳工程技術進行圓紅冬孢酵母菌種改良的啟動子和終止子。為實現本專利技術的目的，本專利技術人對圓紅冬孢酵母中的基因表達情況進行了深入研究，在對圓紅冬孢酵母乳清酸核苷-5 ‘-磷酸脫羧酶及其編碼基因Rtura3研究的基礎上(中國專利，專利申請號:200710158415. 1 ；Yang F, ZhangS, Tang W, Z本文檔來自技高網...
【技術保護點】
１．乳清酸核苷－５′－磷酸脫羧酶啟動子，簡寫為ｐＲｔｕｒａ３，其核苷酸序列具有如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示ＤＮＡ序列的全部或包含該ＤＮＡ序列自３’－末端起９００ｂｐ以內的部分序列，或具有可與如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示序列的全部或其ＤＮＡ序列３’－末端起９００ｂｐ以內的部分序列雜交的、且保持轉錄啟動子活性的序列，或對ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的脫氧核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失或添加所獲得的，與ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示序列具有５０％以上同源性、且具有啟動子活性的序列。
【技術特征摘要】
1.乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶啟動子，簡寫為pRtUra3，其核苷酸序列具有如SEQID NO 1所示DNA序列的全部或包含該DNA序列自3，-末端起900bp以內的部分序列，或具有可與如SEQ ID NO 1所示序列的全部或其DNA序列3，-末端起900bp以內的部分序列雜交的、且保持轉錄啟動子活性的序列，或對SEQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失或添加所獲得的，與SEQ ID NO :1所示序列具有50%以上同源性、且具有啟動子活性的序列。2.—種權利要求1所述乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶啟動子的應用，其特征在于SEQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列可作為啟動子用于構建新型酵母遺傳操作系統及新的重組工程菌株，所得到的基因工程菌株攜帶相應的PRtura3序列。3.按照權利要求2所述乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧...
【專利技術屬性】
技術研發人員：趙宗保，楊帆，張素芳，
申請(專利權)人：中國科學院大連化學物理研究所，
類型：發明
國別省市：91
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