具有與γ磷酸結合的電活性標記的核苷三磷酸制造技術

核苷三磷酸（ＮＴＰ）參與磷酸化反應，其中磷酸基團通過激酶從ＮＴＰ轉移到底物上。在激酶反應中提供的ＮＴＰ的γ磷酸結合于電活性標記，導致該γ磷酸－電活性標記結合物從ＮＴＰ轉移到底物。電活性標記是一種有機部分，如醌或硝基雜環，或者是一種金屬茂，如二茂鐵或二茂鈷。一旦γ磷酸－電活性標記結合物通過激酶轉移到電極結合的底物，磷酸化的發生就通過循環伏安法進行電化學檢測。磷酸化也能夠通過對攜帶了結合電活性標記的γ磷酸的底物進行質譜分析來檢測。含有γ磷酸－電活性標記結合物的ＮＴＰ適用于檢測樣品中激酶存在的方法，篩選調節激酶活性的候選化合物的方法，以及適用于診斷與激酶相關的疾病的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及一種適用于監測與磷酸化相關的事件的新的電活性核苷三磷酸 (nucleotide tiphosphate)。
技術介紹
在細胞通信網絡中，許多酶和受體在“開(或上去，ση”)和“關(或下來， off” )之間轉換，或換句話說，是“磷酸化的”和“去磷酸化的”。在磷酸化期間，來 自ATP的磷酰基轉移至蛋白質特定的絲氨酸，蘇氨酸或酪氨酸殘基。由于這些修飾，蛋 白質的功能或定位可以變化，這在一些情況下可以導致腫瘤蛋白的形成、異常蛋白質磷酸化是許多疾病，包括癌癥、糖尿病和慢性炎性疾病的原因。量 化蛋白質激酶活性的分析方法對于理解其在這些疾病的診斷和療法中的作用是很關鍵 的。目前對于檢測蛋白質磷酸化的方法依賴于放射標記的ATP3、基于熒光的方法4、和 熒光共振能傳遞(FRET)5。近來，結合生物素的ATP分子被開發用于檢測磷酸化反應6。 然而，需要用電活性或光學標記對肽進行其它修飾，這增加了成本并導致了處理過程冗 長和耗時。因此，需要開發一種監測或檢測與磷酸化相關的事件的可替換方法，其能夠克 服當前檢測方法的至少一種缺點。
技術實現思路
現在已經開發了一種新的電活性核苷三磷酸，其適用于監測和/或檢測與磷酸 化相關的事件，包括磷酸化本身的可替換方法中。因此，本專利技術一方面，提供了含有電活性標記的Y磷酸基團的核苷三磷酸結合 物(conjugate)。本專利技術另一方面，提供了一種檢測激酶底物磷酸化的方法，包括(a)在電極表面固定底物；(b)在允許檢測磷酸化活性的條件下，用激酶和含電活性標記的Y磷酸的核苷 三磷酸結合物孵育固定的底物；(c)檢測底物的磷酸化。一方面，磷酸化通過電化學方法檢測。另一方面通過光譜法，包括質譜法檢測磷酸化。本專利技術另一方面，提供了一種檢測樣品中感興趣的激酶的方法，包括(a)在電極表面上固定對感興趣的激酶特異的底物；(b)在允許檢測磷酸化活性的條件下，用樣品和含有電活性標記的Y磷酸的核苷三磷酸結合物孵育固定的底物；和(c)檢測底物的磷酸化，其中底物的磷酸化指示樣品中激酶的存在。本專利技術另一方面，提供了識別候選激酶底物的方法，包括(a)在電極表面上固定候選激酶底物；(b)在允許檢測磷酸化活性的條件下，用含激酶的電解液和含有電活性標記的 Y磷酸的核苷三磷酸結合物孵育固定的底物；和(c)檢測底物的磷酸化，其中候選底物的磷酸化指示所述候選物質是激酶的底 物。本專利技術另一方面，提供了一種篩選調節激酶活性的候選化合物的方法，包括(a)在電極表面上固定激酶底物；(b)在允許檢測磷酸化活性的條件下，用激酶、候選化合物和含有電活性標記的 Y磷酸的核苷三磷酸結合物孵育固定的底物；和(c)檢測底物的磷酸化水平，其中，在缺乏所述化合物時，磷酸化水平從一個磷 酸化水平實現變化指示所述化合物調節所述激酶的活性。本專利技術另一方面，提供了一種高通量篩選樣品中存在蛋白激酶的方法，包括(a)提供一種包含多個電極的微電極陣列；(b)將激酶底物固定于陣列中的每一電極上；(c)用感興趣的樣品和含有電活性標記的Y磷酸的核苷三磷酸孵育攜帶所述用 感興趣的樣品固定的底物的所述微電極陣列；和(d)檢測每一電極中底物的磷酸化水平，其中在多個電極中的一種或多種底物的 磷酸化指示在樣品中存在對一種或多種磷酸化底物特異的激酶。本專利技術另一方面，提供了一種診斷對象中與蛋白激酶的水平異常或缺乏相關的 疾病的方法，包括(a)將與疾病相關的激酶的底物固定于一個或多個電極上；(b)用來自對象的樣品和含電活性標記的Y磷酸的核苷三磷酸孵育攜帶固定底 物的一個或多個電極；(C)檢測每一陣列的電極中底物的磷酸化水平，其中相對于正常對照，在對象樣 品中的異常磷酸化水平或缺乏磷酸化指示所述對象患有或易于患上所述疾病。另一方面，提供了一種包含至少一種固定于電極表面的激酶底物的激酶生物傳 感器，其中所述電極表面浸沒于包含具有電活性標記Y磷酸的電活性核苷三磷酸的電解 液中。又一方面，提供了一種篩選激酶磷酸化的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含至少一種激酶底物、電極、含電活性標記的Y磷酸基團的核苷三磷酸結合物和一種激酶。這些方面的至少一些的一個或多個優點包括(i)適用于監測和/或檢測與磷酸 化相關的事件，包括磷酸化本身的新的電活性核苷三磷酸結合物，Gi)與其它監測和/或 檢測磷酸化的方法相比，新的電活性核苷三磷酸結合物可以以非常低的成本生產，(iii) 檢測或監測與磷酸化相關的事件，包括磷酸化本身的事件的方法并不需要用電活性或光 標記來修飾肽，和(iii)新的電活性核苷三磷酸結合物有助于、簡化和加速包括監測和檢測磷酸化事件包括磷酸化本身的步驟。具體而言，本專利技術的新的電活性核苷三磷酸結合物能夠用于發現新藥，分子診斷劑和分子靶向。本專利技術的這些和其它方面通過以下的詳細描述和接著的附圖會更加清楚，其 中附圖說明圖1是示出了電活性二茂鐵-ATP結合物合成的示意圖；圖2是示出了電化學檢測底物磷酸化的方法中金屬茂-ATP結合物用途的示意 圖；圖3示出了在圖2的方法中采用各種二茂鐵-ATP濃度(a d)獲得的循環伏安 圖；圖4示出了在圖2的方法中存在(a)和不存在(b)PKC下獲得的循環伏安圖；圖5示出了在圖2的方法中存在(a)和不存在(b)的PKC下獲得的方波伏安圖；圖6圖形示出了電流密度依賴于圖2的方法的反應時間的響應；圖7示出了微電極陣列；和圖8 (A-D)示出了微電極陣列的用法。圖9 (A)示出了在含有(a)過表達(over-expressed) CK2 α，(b)內源性 CK2 水平，(C)過表達激酶-死CK2ci，(d)正常表達的CK2ci的細胞溶解產物中實施的CK2-催 化磷酸化反應的方波伏安圖。圖9 (B)是檢測Hela細胞溶解產物中CK2 α過表達狀態的圖表。圖10(A)是在不同CK2 α ‘濃度的(a)-(e)存在下和在酶不存在(f)下，底物肽 的CK2 α ‘-催化的磷酸化的循環伏安圖；圖10(B)說明(a)在分析緩沖液中，(b)在HeLa細胞溶解產物存在下和(c)在 對照實驗中采用底物肽修飾的電極時CK2 α ‘濃度對電流響應的影響。圖Il(A)說明在抑制劑，(1)在不同濃度(a) (e)的TBB(4，5，6，7-四 溴-2-氮雜苯并咪唑)存在下和在CK2ci不存在的對照(f)實驗中，底物肽CK2ci-催化 的磷酸化的抑制作用的循環伏安圖。圖11 (B)說明檢測CK2 α ‘-催化的磷酸化的動力學的雙倒數作圖 (Lineweaver-Burk plot)。圖11 (C)示出了圖11 (A)的對照實驗。圖12(A)示出了在 AbIl-T315I(a)_(d)存在下和 AbIl_T315I 不存在(e)下，用 信號轉導蛋白(STP)肽對酪氨酸激酶-催化的磷酸化的抑制作用的CV。圖12 (B)示出了固定STP肽的AW1-T315I-催化磷酸化的動力學測定的雙倒數作圖。圖12 (C)示出了在具有STP肽(a)、(b)的HeLa細胞溶解產物存在下和對照實 驗(C)，陽極電流依賴于AW1-T315I激酶的量的響應的圖。圖12 (D)示出了電流依賴于一般蛋白激酶抑制劑(b)和(C)和對照實驗(a)濃度 的響應的圖。圖13 (A)示出了在不同濃度(a)、(b)和(C)的HER2/ErbB2本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種核苷三磷酸結合物，含有電活性標記的γ磷酸基團。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：海因茨伯恩哈德克拉茨，卡甘克爾曼，宋海峰，
申請(專利權)人：海因茨伯恩哈德克拉茨，卡甘克爾曼，宋海峰，
類型：發明
國別省市：CA